酪氨酸激酶受體RON在慢性阻塞性肺疾病患者肺組織中的表達及意義

張文波，陳小菊，向小均，冷長燕(川北醫學院附屬醫院呼吸內科，四川南充　637000)

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酪氨酸激酶受體RON在慢性阻塞性肺疾病患者肺組織中的表達及意義

張文波，陳小菊，向小均，冷長燕
(川北醫學院附屬醫院呼吸內科，四川南充637000)

【摘要】目的:觀察酪氨酸激酶受體RON在慢性阻塞性肺疾病( chronic obstructive pulmonary disease，COPD)患者肺組織中的表達及分布，以探討RON在人類COPD發病機制中的作用。方法:收集2013年5月至2013年12月在川北醫學院附屬醫院心胸外科因肺癌進行手術治療的患者，將其分為對照組( 25例)和COPD組( 20例)，于手術切除標本中選取距肺癌病灶5 cm以上的新鮮肺組織。采用免疫組化方法觀察兩組患者肺內RON蛋白的表達和分布情況。結果: COPD組患者肺組織中肺泡區與支氣管區RON蛋白的表達較對照組均明顯增強( P＜0. 05)，而且COPD組患者支氣管區的RON蛋白表達量多于肺泡區( P＜0. 01)結論: COPD患者肺組織中RON的合成與表達增強，其表達量與患者氣流受限嚴重程度相關。

【關鍵詞】酪氨酸激酶受體RON;慢性阻塞性肺疾病;巨噬細胞刺激蛋白;肺泡巨噬細胞

網絡出版時間: 2016-3-4 10∶16網絡出版地址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160304.1016.002.html

慢性阻塞性肺疾病( chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以持續不可逆氣流受限且氣流受限多呈進行性發展為特征的疾病，與氣道和肺組織對有害顆粒或氣體的異常慢性炎癥反應有關。COPD的炎癥由多種炎性細胞、細胞因子及炎癥介質介導且相互作用導致。巨噬細胞是COPD氣道管壁和管腔的主要炎性細胞之一。酪氨酸激酶受體RON( recepteur d'origine nantais)是巨噬細胞刺激蛋白( macrophage stimulating protein，MSP)的特異性受體，在各種免疫細胞中，RON選擇性表達于組織巨噬細胞如肺泡巨噬細胞表面［1］。MSP激活后與RON結合并誘導其生物活性，刺激巨噬細胞釋放氧自由基和炎癥介質，誘導核因子-κB( nuclear factor kappa B，NF-κB)的活化，調節細胞分化、遷移和基質的侵襲等［2－3］。我們之前的動物實驗發現［4］:在煙熏建立的COPD大鼠模型中，COPD大鼠肺組織中RON蛋白及其基因的表達量明顯高于正常大鼠，從而在動物實驗中證實了RON在COPD發病機制中起一定作用。然而，至今未見RON在人類COPD作用的相關研究文獻資料。本實驗通過檢測RON 在COPD患者肺組織的表達及分布，觀察RON是否也在人類COPD發病中起一定作用。

1 　資料與方法

1.1實驗對象及分組

收集2013年5月至2013年12月在川北醫學院附屬醫院心胸外科因肺癌進行手術治療的患者，將其分為對照組( Control) ( 25例)和COPD組( 20 例)，于手術切除標本中選取距肺癌病灶5 cm以上的新鮮肺組織。標本留取大小約2.0 cm×1.0 cm× 1.0 cm，用10%中性甲醛固定24 h后，石蠟包埋，制作蠟塊備用行免疫組化。

COPD組納入標準: ( 1)符合衛生部醫政司《慢性阻塞性肺疾病診療規范( 2011年版)》的診斷標準［5］; ( 2)肝腎功能正常。排除標準: ( 1)呼吸系統其他疾病; ( 2)其他系統疾病如:高血壓病、冠心病、惡性腫瘤、結締組織病、代謝性疾病、骨關節疾病、神經肌肉疾病等; ( 3) 6個月內接受過手術治療; ( 4)術前已進行過放療或化療。

對照組納入標準: ( 1)肺功能檢查正常; ( 2)肝腎功能正常。排除標準: ( 1)其他呼吸系統疾病; ( 2)其他系統疾病如:高血壓病、冠心病、惡性腫瘤、結締組織病、代謝性疾病、骨關節疾病、神經肌肉疾病等; ( 3) 6個月內接受過手術治療; ( 4)術前已進行過放療或化療。

1.2方法

( 1)一般情況分析:年齡、性別、肺功能等。

( 2)肺功能檢測:選用我院肺功能儀，術前1周進行肺功能檢測，每次均檢測相同的技術指標，包括FVC、FEV1%、FEV1/FVC%和MVV等肺功能參數，吸入沙丁胺醇200 μg 15 min后進行肺功能檢測，檢測前24 h不使用支氣管舒張劑。

( 3)免疫組化檢測肺組織RON的表達:采用鏈霉親和素-生物素復合物( strept avidin-biotin complex，SABC)法，主要步驟為:切片常規脫蠟至水，滴加3%H2O2室溫孵育10 min以滅活內源性過氧化物酶，將切片浸入0.01M枸椽酸鹽緩沖液( pH 6.0)加熱修復抗原，滴加5% BSA封閉液室溫孵育10 min，滴加適當稀釋的兔抗大鼠RON一抗( 1∶200)， 4℃孵育過夜，滴加適當稀釋的二抗(生物素化山羊抗兔IgG 1∶100)，37℃孵育30 min，滴加試劑SABC ( 1∶100) 37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素輕度復染，常規脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

( 4)免疫組化結果判斷:在OLYMPUS DP70顯微鏡高倍鏡視野下觀察，陽性:棕黃色或黃色顆粒表達于細胞胞漿和(或)胞膜上。應用Image-Pro Plus 6.0圖文分析軟件，于每張免疫組化染色片的肺泡區和支氣管區各隨機不重復采圖5張，測量每張圖片肺泡區和支氣管區的平均光密度值，再取其平均值作為該患者肺泡或支氣管組織RON蛋白表達含量進行統計分析。

1.3統計學分析

所有數據均采用統計軟件SPSS 16.0進行處理，服從正態分布的計量資料以均數±標準差(±s)表示，兩組間比較采用t檢驗;不服從正態分布的計量資料以中位數(四分位間距)表示，即M( QR)，兩組間比較采用成組設計兩樣本秩和檢驗或配對設計符號秩和檢驗;性別差異比較采用卡方檢驗。相關性分析采用Spearson相關。檢驗水準設為:α= 0. 05。

2　結果

2.1一般情況比較

兩組患者年齡、性別比較無顯著性差異( P＞0. 05)。COPD組的FEV1/FVC%及FEV1%較對照組均明顯降低，具有統計學意義( P均＜0.01) (表1)。

表1　受試者一般情況比較［x±s或M( QR)］

2.2肺組織中RON蛋白的比較

肺組織免疫組化結果顯示:在肺泡區，RON蛋白表達于COPD患者的大部分肺泡上皮細胞、肺泡巨噬細胞的細胞膜和細胞漿內，呈明顯的棕黃色或黃色顆粒樣改變(圖1)，而對照組僅部分肺泡上皮細胞的胞膜和胞漿內見淡黃色顆粒的RON蛋白表達(圖2)。在支氣管區，RON蛋白表達于COPD患者大部分支氣管柱狀上皮細胞及巨噬細胞的胞膜和胞漿內，呈明顯的棕黃色或黃色顆粒樣改變(圖3)，而對照組僅部分支氣管柱狀上皮細胞的胞膜或胞漿內見淡黃色顆粒的RON蛋白表達(圖4)。經統計學分析，COPD組肺泡區、支氣管區平均光密度值均顯著高于對照組，有顯著統計學意義( P＜0. 05) ; COPD組的支氣管區平均光密度值顯著高于肺泡區，其差異也具有統計學意義( P＜0. 01) ;而對照組的支氣管區平均光密度值與肺泡區比較則無統計學意義( P＞0. 05) (表2)。2．3 COPD患者肺組織中RON蛋白表達量與肺功能的相關分析

表2　兩組患者肺組織中RON蛋白的比較［平均光密度，M(QR)］

圖1　COPD組肺泡區RON表達：肺泡Ⅰ型細胞（，肺泡Ⅱ型細胞（　），肺泡巨噬細胞（）（SABC×1000）

圖2　對照組肺泡區RON表達：肺泡Ⅰ型細胞（，肺泡Ⅱ型細胞（　），肺泡巨噬細胞（　）（SABC×1000）

圖3　COPD組支氣管區RON表達：肺泡巨噬細胞（，支氣管假復層纖毛柱狀上皮細胞（），（SABC×1000）

COPD患者肺泡區及支氣管區RON蛋白表達量水平與肺功能的FEV1%均呈負相關(表3)。

表3　COPD患者肺組織中RON蛋白表達量與FEV1%相關性

圖4　對照組支氣管區RON表達：支氣管假復層纖毛柱狀上皮細胞（），肺泡巨噬細胞（）（SABC×1000）

3　討論

酪氨酸蛋白激酶受體RON是MSP的特異性受體。而且MSP為目前已知的受體型酪氨酸蛋白激酶RON的唯一特異性配體［6－7］。RON的分布與表達僅限于在上皮起源性細胞中［8］。研究顯示，在成年大鼠除了脾臟和心臟外的各器官中均可見RON的轉錄與表達［9］。另有研究發現［10］，在正常甲狀腺細胞中幾乎檢測不到RON。RON激活的方式有兩種，即配體依賴和配體非依賴方式。( 1)配體依賴方式:在病理狀況下，pro-MSP經酶水解后，在細胞表面形成成熟的雙鏈蛋白MSP與RON結合后，RON的SEMA域與MSP的β鏈(主要的受體結合位點［7，11］)以“酶-底物”模式結合而引起RON受體分子同源二聚化，從而誘導其磷酸化和激酶的生物活性，RON構象發生變化，C末端產生特殊的結合信息分子的多功能錨定位點。多功能錨定位點是RON與下游信息分子接觸、傳遞信息的重要結構點［12］; ( 2)配體非依賴方式: RON也能在沒有配體MSP存在的情況下進行信號轉導，通過整合素介導細胞與細胞外基質( extracellular matrix，ECM) (如Ⅳ型膠原)間的黏附也能引起RON發生自身磷酸化而激活。活化的RON激活多種信號蛋白，通過不同的級聯途徑向細胞內轉導各種信號，如Ras/絲裂原活化蛋白激酶( mitogen activated protein kinase，MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶( phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K) /AKT、jun N-末端激酶( jun N-terminal kinase，JNK) /應激激活蛋白激酶、β-catenin、Smad和NF-κB分子等，調節細胞的生長、遷移、轉化和分化［13］。

本研究通過免疫組化方法發現COPD和對照組患者肺組織中肺泡上皮細胞、巨噬細胞和氣管支氣管纖毛柱狀上皮細胞中均有RON蛋白表達，但COPD組肺組織中肺泡區與支氣管區RON蛋白的表達明顯強于對照組，兩組之間的差異具有統計學意義。提示COPD患者肺組織中RON的合成和表達增強。這與動物實驗研究結果一致［4］。進一步通過相關分析發現，COPD患者肺組織中RON蛋白表達量水平與肺功能的FEV1%呈負相關( r絕對值＞0. 5)。提示，隨著RON蛋白表達量增加，COPD患者FEV1%逐漸降低，因此，我們推測RON在COPD發生發展中起一定的作用，且與COPD的氣流受限嚴重程度相關。本研究還發現，COPD組的支氣管區RON蛋白表達量多于肺泡區，然而在對照組中的氣管區RON蛋白表達量與肺泡區相差不大，也就是說在COPD患者中，RON更多表達在氣管支氣管的上皮細胞中。這提示RON更多參與的是氣道的炎癥機制。

本試驗顯示，COPD患者肺泡上皮細胞及氣道上皮細胞中有較高的MSP受體RON表達，而活化的MSP與RON相結合后可激活信號通路參與炎癥反應如刺激氣道炎性細胞產生炎癥介質如白細胞介素-6( Interleukin-6，IL-6)、白細胞介素-8( Interleukin-6，IL-8)、腫瘤壞死因子-α( Tumor Necrosis Factor-alpha，TNF-α)、白細胞介素-1 β( Interleukin-1 beta，IL-1 β)等增多［14］。提示RON在COPD的發病機制中發揮重要作用，可能主要是參與氣道炎癥的調節。

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(學術編輯:杜飛)

呼吸系統疾病研究專題·論著

The expression and significance of RON receptor tyrosine kinase in chronic obstructive pulmonary disease patients

ZHANG Wen-bo，CHEN Xiao-ju，XIANG Xiao-jun，LENG Chang-yan
( Department of Respiratory Medicine，Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，Sichuan，China)

【Abstract】Objective: To evaluate the role of receptor tyrosine kinase RON in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease( COPD)，we observed the expression and distribution of RON in the lung tissue of people suffering from COPD.Methods: The lung tissue samples were obtained from 20 COPD patients and 25 controls with operation because of lung cancer in North Sichuan Medical College Affiliated Hospital from May 2013 to December 2013.The expression and distribution of RON protein in the lung tissue of each group was observed by immunohistochemistry.Results: The levels of RON protein in the bronchus region and alveolar region of the lung from the COPD patients were outstandingly higher than those of the control( P＜0. 05)，and the expression of RON protein in COPD patients bronchus region was more than the alveolar region.Conclusion: The expression of RON protein in lung tissue of the patients with COPD is stronger.The expression levels of RON protein in lung tissue of the COPD patients are related to the severity of airflow limitation.

【Key words】Receptor tyrosine kinase RON; Chronic obstructive pulmonary disease; Macrophage stimulating protein; Alveolar macrophage ( AM)

作者簡介:張文波( 1982－)，男，碩士研究生，住院醫師。通訊作者:陳小菊，E-mail: cxj9592@163.com

基金項目:四川省衛生廳科研項目( 070293)

收稿日期:2015－05－25

doi:10. 3969/j. issn. 1005-3697. 2016. 01.01

【文章編號】1005-3697( 2016) 01-0002-04

【中圖分類號】R563

【文獻標志碼】A