siRNA抑制缺氧誘導因子-1ɑ表達對人視網膜母細胞瘤細胞增殖與凋亡的影響

郎莉莉，高　玉，葛茸茸，陳建梅，景　明

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siRNA抑制缺氧誘導因子-1ɑ表達對人視網膜母細胞瘤細胞增殖與凋亡的影響

郎莉莉，高玉，葛茸茸，陳建梅，景明

［摘要］目的觀察siRNA抑制人視網膜母細胞瘤表達低氧誘導因子(HIF)對細胞增殖和凋亡的影響。方法以Y-79細胞系為研究對象，分別在正常氧和低氧環境下培養，MTT法檢測細胞增殖，RT-PCR和Western blot檢測HIF-1ɑmRNA和蛋白質水平的表達變化，siRNA抑制細胞表達HIF-1ɑ，膜聯蛋白V-FITC和PI雙染法流式細胞術檢測細胞凋亡情況，熒光評估測定法檢測半胱天冬酶活性。SPSS 16．0軟件包作統計學分析，配對t檢驗。結果與常氧和低氧環境培養Y79細胞比較，在0、4、8、12 h后HIF-1ɑmRNA和蛋白質數倍高表達。siRNA干擾技術處理24、48、72 h后，常氧環境培養下的Y-79細胞表達HIF-1ɑ呈時間依賴性輕度下降趨勢，低氧條件下呈顯著下降。siRNA HIF-1ɑ可能是通過上調Bax/Bcl-2比率和活化caspase-9、caspase-3途徑促進Y-79細胞凋亡。結論siRNA HIF-1ɑ下調人視網膜母細胞瘤表達低氧誘導因子，可抑制細胞增殖和促進細胞凋亡。抑制HIF-1ɑ表達可能是治療視網膜母細胞瘤的潛在新策略。

［關鍵詞］低氧誘導因子-1ɑ;人視網膜母細胞瘤;細胞增殖;細胞凋亡

［作者單位］200120上海，同濟大學附屬東方醫院眼科(郎莉莉、陳建梅)，解放軍第四一一醫院眼科(高玉、葛茸茸、景明)

視網膜母細胞瘤(retinoblastoma，RB)是嬰幼兒最常見的眼內惡性腫瘤，其發病率約為1/15 000～20 000，嚴重威脅和危害患兒的視力甚至生命［1-2］。隨著對RB認識的不斷深入，其診斷和治療正在發生著快速的變化［3］。除了傳統的眼球摘除術和外放射治療，過去的十年里，系統性化療已成為了首選的治療手段［4-5］。但以上方法均存在安全性低、不良反應嚴重等諸多不足。基因治療相對于傳統治療方法則具有安全性高、無不良反應的優勢而受到廣泛關注。腫瘤組織缺氧是惡性腫瘤的重要生物學特征，由于新生血管生成不足、不規則血供、癌細胞快速增殖引起的氧消耗補償不良所導致的瘤內缺氧是實體瘤的常見現象［6-7］。缺氧條件下，腫瘤細胞調控血管形成、腫瘤侵襲與轉移、細胞周期與凋亡以及對放化療抵抗性等許多基因的轉錄和表達發生變化。缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)由α亞基和β亞基組成，在缺氧誘導的基因表達變化中起關鍵作用［8］。國外的研究觀察到在RB的發生發展過程中HIF-1α高表達［9］，證實了缺氧現象同樣存在于RB。國內的研究則表明，RB腫瘤組織中HIF-1ɑ的表達與血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達呈正相關，認為HIF-1ɑ可作用于VEGF，在RB血管形成中起到一定作用，從而促進RB的發生發展［10-11］。最近，Fernandes等報道利用RNA干擾技術敲除HIF-1ɑ表達可以顯著降低RB腫瘤細胞的增殖，但這一現象的發生機制并不清楚［12］。筆者利用RNA干擾技術觀察了HIF-1ɑ對人RB Y-79細胞增殖、凋亡和凋亡途徑的影響，可能有助于深入理解HIF-1ɑ在視網膜母細胞瘤中的病理作用，預示HIF-1ɑ可作為RB基因治療的一個新靶標。

1　材料與方法

1．1細胞株及其培養人RB Y-79細胞株從美國典型培養物保藏中心(ATCC，VA，USA)獲得。Y-79細胞利用RPMI1640培養基(invitrogen life technologies，ON，USA)添加10%胎牛血清、1 250 mg/L兩性霉素B、100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素。所有的培養物保持在含有5%CO2和21%O2的37℃濕潤的空氣中。

1．2細胞的缺氧處理缺氧(≤1%O2)的實現按照文獻描述使用氣體發生器系統［13］。

1．3細胞的siRNA處理siRNA敲除HIF-1ɑ如文獻所述［14］。分別合成siRNA HIF-1ɑ正義鏈:5-AGAGGUGGAUAUGUGUGGGdTdT-3和反義鏈5-CCCACACAUAUCCACCUCUdTdT-3。一個靶標是無關mRNA的siRNA作為非特異性的對照。細胞在無血清培養基中轉染siRNA(100 nmol/L)5 h，使用metafectene試劑(Biontex，München，Germany)。靶基因消除的確定通過RT-PCR和Western blot檢測。1．4 RT-PCR分析總RNA的抽提使用Trizon廠商說明書，第一鏈cDNA使用PrimeScriptTMRT試劑盒合成(Takara，Shiga，Japan)。RT-PCR使用SYRB green PCRMaster Mix(Takara)。每個擴增反應進行變性95℃30 s，在95℃5 s擴增40個循環，退火和延伸在60℃20 s，使用ABI7500序列檢測系統(life technologies)。β-actin作為管家基因。

1．5 Western blot分析總的細胞抽提物按照文獻描述使用裂解液(50 mmol/L HEPES，100 mmol/L NaCl，2 mmol/L乙二胺四乙酸，0．1%3-［(3-膽酰胺丙基)二］-1-丙烷磺酸，10%蔗糖，5 mmol/L DTT)［14］。裂解液孵化在4℃，30 min，離心13 000 r/min，10 min，收集上清液和蛋白濃度的測定用Bradford方法［15］。蛋白質在10%SDS-PAGE分離和電轉聚偏氟乙烯氟膜。PVDF膜Tris緩沖生理鹽水用5%牛血清白蛋白封閉37℃2 h后，加入1:1 000一抗孵育4℃過夜，用PBS-T洗膜3次，加入二抗，37℃孵育2 h。蛋白條帶的檢測使用增強化學發光檢測試劑盒(碧云天，南通，中國)。

1．6細胞增殖實驗MTT實驗檢測細胞增殖，細胞(1×104細胞/孔)接種于96孔板中，貼壁過夜，按照設定的時間(24、48、72 h)轉染siRNA HIF-1ɑ，每孔添加10μl MTT溶液(5 g/L)，37℃孵育4 h后移去MTT液，添加100μl DMSO，ELISA酶標儀檢測活細胞數。

1．7細胞凋亡檢測用Annexin V-FITC和PI雙染色法檢測細胞凋亡。轉染siRNA HIF-1ɑ48 h后，冷PBS清洗細胞，用結合緩沖(10 mmol/L HEPES/NaOH，pH 7．4，140 mmol/L NaCl，2．5 mmol/L CaCl2)重新懸浮。室溫下Annexin V-FITC和PI染色15 min，1 h內使用流式細胞儀(Becton-Dickinson，San Jose，CA)檢測。V+/PI-cells細胞被定義為凋亡細胞。應用CellQuest(Becton-Dickinson)軟件計算出的凋亡細胞百分比。

1．8半胱天冬酶(caspase)活性分析用熒光評估測定法檢測半胱天冬酶活性。細胞處理后，細胞(2 ×105細胞/孔)用裂解緩沖液收獲。按照先前描述的離心法分離蛋白、確定濃度［14］。來源于各個樣本的等量蛋白和caspase-3底物DEVD-AFC或者caspase-9底物LEHD-AFC共同孵育在37℃30 min。通過熒光分光光度計(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)定量活性。

1．9統計學處理利用SPSS 16．0軟件包進行統計學分析。所有實驗重復3次，數據以均數±標準差(±s)表示。統計分析采用一個配對測試，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2．1缺氧上調人RB Y-79細胞表達HIF-1ɑ在常氧條件下，人RB Y-79細胞表達低水平的HIF-1ɑ mRNA。然而，在此研究中能夠檢測到該細胞穩定表達HIF-1ɑ蛋白。細胞暴露于低氧環境中，觀察到HIF-1ɑmRNA和蛋白水平的表達成倍增加。這些數據表明，缺氧上調人RB Y-79細胞HIF-1ɑ的表達(圖1、2)。

圖1　RT-PCR檢測人RB Y-79細胞HIF-1ɑm RNA表達

圖2　Western blot檢測人RB Y-79細胞HIF-1ɑ蛋白表達

2．2 siRNA HIF-1ɑ抑制人RB Y-79細胞表達HIF-1ɑ

為確定siRNA HIF-1ɑ是否能抑制人RB Y-79細胞表達HIF-1ɑ，遂將siRNA HIF-1ɑ轉染細胞24 h后進行RT-PCR和Western blot分析。結果表明，在常氧和缺氧條件下人RB Y-79細胞表達HIF-1ɑ的mRNA和蛋白水平被抵消或者消除(圖3、圖4)。

圖3　RT-PCR檢測人RB Y-79細胞HIF-1ɑmRNA表達

圖4　Western blot檢測人RB Y-79細胞HIF-1ɑ蛋白質表達

2．3敲除HIF-1ɑ抑制人RB Y-79細胞增殖MTT實驗檢測(酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量)HIF-1ɑ基因在細胞增殖中的作用。常氧和缺氧條件下，當人RB Y-79細胞敲除HIF-1ɑ基因后，細胞增殖表現為明顯的時間依賴性降低(圖5、6)。這些結果表明，HIF-1ɑ參與人RB Y-79的細胞增殖。

圖5　常氧條件下人RB Y-79細胞增殖情況

圖6　缺氧條件下人RB Y-79細胞增殖情況

2．4敲除HIF-1ɑ誘導人RB Y-79細胞凋亡Annexin V-FITC和Propidium Iodide雙染法流式細胞術檢測HIF-1ɑ在細胞凋亡中的作用。當敲除人RB Y-79細胞HIF-1ɑ基因后，相對于對照組，凋亡細胞百分比顯著上升，在缺氧條件下更加敏感。結果表明，在人RB Y-79細胞中，siRNA HIF-1ɑ誘導的凋亡是功能性缺失HIF-1ɑ的特定結果(圖7)。

2．5敲除HIF-1ɑ誘導人RB Y-79細胞凋亡的機制

為了解人RB Y-79細胞敲除HIF-1ɑ誘導其凋亡的機制，筆者對細胞凋亡相關分子(Bax/Bcl-2比率、caspase-9、caspase-3)進行了研究。結果表明，相對于對照組，敲除人RB Y-79細胞HIF-1ɑ能提高Bax/Bcl-2比值、活化caspase-9激活劑和caspase-3效應劑;在常氧條件下，觀察到了類似但微弱的結果(P＞0．05，差異無統計學意義)(圖8、9、10)。

圖7　Annexin V-FITC和Propidium Iodide雙染法流式細胞術檢測HIF-1ɑ對人RB Y-79細胞凋亡的影響

圖8敲除HIF-1ɑ對人RB Y-79細胞Bax、Bcl-2表達的影響

3　討論

在細胞環境中，HIF-1ɑ被證明參與癌癥生物學的許多重要方面，包括血管生成、細胞存活、侵襲和凋亡以及對化、放療的抵抗性［16］。更有研究表明HIF-1ɑ參與促進RB細胞的存活和增殖［12］。但至目前為止，HIF-1ɑ在RB細胞增殖與凋亡中的作用仍知之甚少。本研究中，筆者首次觀察了常氧和缺氧條件下，siRNA敲除人RB Y-79細胞HIF-1ɑ后對其細胞增殖、凋亡和凋亡途徑的影響。

圖10　敲除HIF-1ɑ對人RB Y-79細胞caspase-3活性的影響

在常氧條件下，HIF-1ɑ是von Hippel-Lindau腫瘤抑制蛋白的靶標，通過泛素蛋白酶體途徑降解。然而，在缺氧條件下，這一過程被抑制，導致轉錄因子穩定積累。本研究中，人RB Y-79細胞暴露于缺氧環境誘導HIF-1ɑmRNA和蛋白水平成倍增加; siRNA HIF-1ɑ敲除HIF-1ɑ后對人RB Y-79細胞活力和凋亡的誘導有明顯的影響。上述結果表明，通過siRNA HIF-1ɑ誘導人Y-79 RB細胞凋亡是HIF-1ɑ功能缺失的結果。Bax/Bcl-2比率是調控細胞死亡的“可變電阻器”，在外界因素刺激下，細胞的生死最終取決于BAX和BCL-2兩種調控因子的平衡結果。作為細胞凋亡調節因子家族，caspase家族在凋亡的執行過程中占據著中心地位，直接參與凋亡啟動、信號傳遞及凋亡效應，其中，caspase-9能在多種內、外源性刺激因子的作用下表達，通過線粒體通路激活其效應子caspase-3，從而誘導細胞凋亡。有研究表明，典型的線粒體凋亡級聯反應，包括增加Bax/Bcl-2比值和半胱天冬酶活化，參與了缺氧/HIF-1ɑ介導的抗凋亡和細胞生存過程［17］。上述研究結果表明，敲除HIF-1ɑ可以提高Bax/Bcl-2比值、活化凋亡激活劑caspase-9和凋亡效應劑caspase-3，缺氧條件下該效應更為敏感。

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(本文編輯:彭潤松)

Inhibition of hypoxia inducible factor 1αby siRNA-induced apoptosis in human retinoblastoma cells

Lang Lili，Gao Yu，Ge Rongrong，Chen Jianmei，Jing Ming
(Department of Ophthalmology，Dongfang Hospital，Affiliated to Tonji University，Shanghai200120，China)

［Abstract］Objective To investigate the effect of hypoxia inducible factor-1ɑknocked down by small interfering RNA(siRNA)on cell proliferation，apoptosis and apoptotic pathways ofhuman Y-79 RB cells．MethodsCell proliferation，HIF-1ɑmRNA and protein levels were measured by MTT，RT-PCR and Western Bloton human Y-79 RB cells under both normoxic and hypoxic conditions，respectively．siRNA knockdown against HIF-1ɑwas carried out to suppress the expression of HIF-1ɑ．Cell apotosiswas determined by double staining cellswith the annexin V-FITC and PI．Caspase activity was assessed by the fluorometric assay．Biostatistical analyses were conducted with SPSS 16．0 software package．Results Amultifold increase in HIF-1ɑmRNA and protein levelswere observed after cellswere exposed to the hypoxic environ mentat0 h，4 h，8 h and 12 h．BothmRNA and protein levels of HIF-1ɑwere attenuated or abolished by transfection with siRNAHIF-ɑunder normoxic and hypoxic conditions．Futhermore，knockdown of HIF-1ɑcould enhance hypoxia-induced slight increase of Bax/Bcl-2 ratio and activate caspase-9 and caspase-3．Conclusion This study was able to show that a knockdown of HIF-1ɑby siRNAHIF-1ɑresulted in a decrease in proliferation and induction of apoptosis in human Y-79 RB cells under both normoxic and hypoxic conditions．HIF-1ɑexpression may be a promising strategy for the treatment of human RB in the future．

［Key words］Hypoxia inducible factor 1α;siRNA;Y-79 retinoblastoma cells

(收稿日期:2015－09－24)

［通信作者］高玉，電子信箱:gyhqyygy@sina．com

［基金項目］上海市衛生和計劃生育委員會科研資助課題(201540304)，上海市虹口區衛生和計劃生育委員會科研資助課題(虹衛1402-11)

［中圖分類號］R774

［文獻標識碼］A［DOI］10．3969/j．issn．1009－0754．2016．01．009