組織蛋白酶B在膀胱移形細胞癌中表達與復發的相關性*

唐碩 魏強 王安果 張宗平 文焰林 李云祥

組織蛋白酶B在膀胱移形細胞癌中表達與復發的相關性*

唐碩1魏強2王安果1張宗平1文焰林1李云祥1

(1.川北醫學院第二臨床醫學院·南充市中心醫院泌尿外科, 四川 南充637000；

2.四川大學華西醫院泌尿外科， 四川 成都 610041)

目的 探討組織蛋白酶B(CB)在膀胱移行細胞癌(BTCC)組織中的表達及與腫瘤復發的關系。方法 收集1994～2011年復發的膀胱移形細胞癌標本，共計病理組織切片172份，用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法行CB免疫組織化學染色并計算CB陽性細胞百分率。 結果 癌組織中CB陽性細胞以彌散分布為主,細胞周圍基質染色明顯。BTCC組織中CB標記指數(21.53±4.27)較正常組織(0.34±0.18)明顯升高(P<0.05)；高分級癌組織中CB標記指數(27.25±4.82)較低分級(14.38±5.83)明顯增高(P<0.05)；復發組隨復發次數進一步增高(P<0.05)；分期高的癌組織中CB值(24.68±5.42)較低期癌組織中(17.24±6.23)明顯升高(P<0.05)。結論 組織蛋白酶B在正常膀胱粘膜中幾乎不染色或僅見少許零星的陽性細胞，在分級和分期高的癌組織中染色明顯，多為彌散陽性染色,CB可作為判斷BTCC患者的進展和預后的一個重要指標。

組織蛋白酶B; 膀胱移形細胞癌; 復發; 免疫組化

腫瘤復發預示著腫瘤細胞的活動, 復發與轉移是關注的焦點, 惡性腫瘤的復發顯示了腫瘤細胞的動態活動，復發本身就是對患者的直接損害，不僅如此，腫瘤細胞的動態活動還預示著腫瘤的浸潤與轉移。組織蛋白酶B(CB)在多種惡性腫瘤中呈現高表達并與侵襲和轉移相關。本研究通過免疫組織化學方法,檢測CB在復發性膀胱癌中的表達,探討其與膀胱移行細胞癌(BTCC)復發以及不同的病理分級，臨床分期之間的關系，從而為膀胱移行細胞癌的早期診斷，腫瘤進展，腫瘤復發，惡性程度評估，以及預后提供重要的依據。

1 材料與方法

1.1 材料來源 收集1994～2006年76例復發膀胱移形細胞癌標本病理組織172份。其中男57例，女19例，年齡28～81歲，平均58.9歲。其中，123例次行TUR-Bt術，18例次行膀胱部分切除術，31例次行根治性膀胱切除術。所有患者術前均未行全身藥物化療、放射治療以及免疫生物治療。172份病理標本按WHO新病理標準分級：低級別腫瘤92例，高級別腫瘤80例。另取16例正常膀胱粘膜作為正常對照。

1.2 檢測方法 采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(SP 法)，取各組組織石蠟切片，常規二甲苯脫蠟，乙醇水化。用蒸餾水新鮮配置3%H2O2-甲醇液去除內源性過氧化物酶，然后用正常兔血清封閉。用 1∶200兔抗人CB (武漢博士德生物工程有限公司)作為一抗，滴加后 4 ℃過夜；次日滴加羊抗兔 IgG 作為二抗，作用 60 min，與鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶復合物培養 30 min。二氧基聯苯胺顯色，蘇木精復染。二抗試劑盒由美國ZYMED公司生產。每次試驗均設置陰性對照，以磷酸鹽緩沖液代替一抗，結果顯示陰性。在在高倍鏡下每一組織切片中隨機選擇 10 個區域，共計數 2 000 個細胞，計算 CB 陽性細胞百分比。CB 陽性細胞為細胞質或細胞核呈棕色，顆粒狀或彌散狀染色，其余則為陰性細胞。

1.3 統計學處理 采用統計學SPSS11.5軟件，數據采用均數±標準差表示，應用方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

組織蛋白酶B 在癌組織中可為細胞核染色,還可同時伴有基質染色,基質染色可在組織蛋白酶B 陽性細胞周圍,也可表現為腫瘤細胞單純基質染色，并且在腫瘤細胞周邊部染色更明顯。在正常膀胱組織中基質無著色。組織蛋白酶B 陽性細胞分布于BTCC的自基層到表層的所有層中,其標記指數與切片腫瘤分級、分期密切相關，根據相關臨床數據統計也與腫瘤復發密切相關。

將膀胱癌組織與正常組織進行組織蛋白酶B表達的比較發現正常組織中16例組織蛋白酶B陽性，組織蛋白酶B陽性細胞率(0.34±0.18)%，而在癌組織中卻可見到明顯的表達，172例陽性，組織蛋白酶B陽性細胞率(21.53±4.27)%，較正常組織明顯升高(P<0.05)。

病理分級中，高分級癌組織中組織蛋白酶B標記指數較低分級明顯增高，其差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。通過對復發組與原發組的比較，發現隨著復發次數的增加其表達會進一步增強，其差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表1 BTCC組織中組織蛋白酶B與病理分級的關系

Table 1 The relationship of cathepsin B and pathological grading in BTCC tissues

BTCC病理n組織蛋白酶B陽性細胞低級9214.38±5.83高級8027.25±4.82①

注：①和低分級癌組織相比P<0.05

表2 BTCC組織中組織蛋白酶B表達與復發的相關性

Table 2 The expression correlated of cathepsin B with recurrence in BTCC tissues

樣本n組織蛋白酶B陽性細胞正常對照組160.34±0.18原發組7617.48±7.20第一次復發組4120.52±5.28第二次復發組3222.98±5.39第三次或以上復發組2325.124±4.53

注：每組間比較P<0.05

3 討論

Cathepsin B屬于半胱氨酸蛋白酶類。組織蛋白酶B通常以酶原的形式存在，需要激活后才能降解蛋白，組織蛋白酶B具有雙重蛋白水解活性使之能直接參與多種基底膜蛋白降解。生理情況下約10%酶原被分泌至胞漿，然后被其他蛋白水解酶水解或自身激活，參與許多生理過程，如激素原激活、抗原呈遞、組織器官發育等[1]。但病理狀態下，各種原因所致細胞損傷，如病原微生物、炎癥因子及氧化應激等，導致溶酶體膜穩定性降低，通透性增高甚至破裂，大量組織蛋白酶B釋放到胞漿或組織間隙，并被激活，介導細胞炎性壞死及凋亡的發生[2]，與關節炎、胰腺炎及其他急慢性炎癥性疾病有關。組織蛋白酶B還參與腫瘤血管的形成，新生血管形成是腫瘤生長、轉移發展所必需的，其形成不僅使腫瘤生長，而且由于新生血管基底膜的缺損從而提供了癌細胞進人血管的途徑，促進腫瘤細胞的血行擴散[3]。Sinha等用原位雜交技術發現人前列腺癌組織中，CBmRNA呈不均勻染色，且在腫瘤浸潤邊緣染色最深，同時還發現前列腺癌內皮細胞中組織蛋白酶B表達增高，在正常及BPH中則不增加，這提示組織蛋白酶B可能參與前列腺癌組織中血管的生成[5，6]。以上這些現象和研究均說明CB可以促進腫瘤血管的形成，代表了腫瘤的轉移或轉移趨勢。

Weiss等應用浸潤性移行細胞癌細胞系EJ和非浸潤性移行細胞癌細胞系RT4觀察了組織蛋白酶B在人類膀胱腫瘤浸潤中的作用[7]。浸潤性EJ細胞具有位于胞漿膜活性的組織蛋白酶B而非浸潤性RT4細胞則限于溶酶體中，主要是其前體形式。EJ 細胞胞質膜而不是RT4 細胞系的胞質膜具有降解純化的層粘連蛋白的能力;認為浸潤性腫瘤細胞在其胞質膜中具有增強的組織蛋白酶B,可降解基底膜成分而利于腫瘤的浸潤和轉移。 Eijan等發現膀胱癌患者尿液中組織蛋白酶B的活性較高，并與腫瘤分期、分級相關[9，10]。應用Wester blot分析膀胱移行細胞癌標本，結果表明浸潤型較淺表型CB表達高[9]。在骨肉瘤中也有類似發現，在肉瘤侵襲邊緣的組織蛋白酶B存在高表達現象，而在其相鄰的正常組織中則無表達最近的研究表明，膀胱腫瘤病人癌組織的細胞組織蛋白酶B、組織蛋白酶B高于對照組及癌旁組織[10，11]。同時還表明癌組織細胞不僅表達更多的組織蛋白酶而且更易釋放組織蛋白酶，在細胞膜降解、腫瘤侵襲方面扮演著積極的角色。

4 結論

組織蛋白酶B 陽性表達在分級和分期高的癌組織中較低級、低期癌組織中增強，且在腫瘤組織的周邊部染色更明顯，出現組織蛋白酶B陽性細胞聚集或基質染色，表明伴隨惡性度的增高,組織蛋白酶B陽性表達增高,提示其與膀胱癌惡性度的相關性。通過對每次復發的比較，發現隨著復發次數的增加組織蛋白酶B陽性標記指數在一定范圍內增加，一旦出現分級突破其標記指數會顯著增加，揭示了組織蛋白酶B在腫瘤復發與演進中的表達意義。

【參考文 獻】

[1]Turk V, Turk B, Turk D. Lysosomal cysteine proteases: facts and opportunities[J].EMBO J,2001,20(17): 4629-4633.

[2]Frohlich E, Schlagenhauf B, Mohrle M,etal. Activity, expression, and transcription rate of the cathepsins B, D, H, and L in cutaneous malignant melanoma[J]. Cancer, 2001,91(5): 972-982.

[3]王婭蘭，林曉.粘液性大腸癌組織蛋白酶B、D表達與腫瘤浸潤[J].實用腫瘤學雜志, 2003,4:249-251.

[4]彭杰;唐清碧。重組人血管內皮抑素聯合FoLFox4方案治療結直腸癌肝轉移的臨床觀察[J].西部醫學,2012，24(7)：1270-1271.

[5]Sinha AA,Danald F,Gleason,etal.Cathepsin B in angioyeuesis of human prosfate:an immunohistochemical and immunoelection microscopic andlysis[J]. The anatomical Record,1995,241:353.

[6]Sinha AA.Localization of lsiotinglated Catlepsin B oligonucleotide prostate including in vasive cells and invasive edge by in situhybridization[J].Anat Rec,1993,235:233.

[7]Weiss RE，Liu BC-S，Ahlering T,etal．Mechanisms 0f human bladder tumor invasion：role of protease cathepsin B[J]. Urol，l990，144：798.

[8]Eijan AM, Sandes E, Puricelli L,etal. Cathepsin B levels in urine from bladder cancer patients[J]. Oncol Rep, 2000, 7: 1395-1399.

[9]Eijan AM, Sandes EO,Riveros MD,etal. High expression of cathepsin B in transitional bladder carcinoma correlates with tumor invasion[J]. Cancer,2003,98(2) :262-268.

[10] Andrea Staack, DianaTolic, Glen Kristiansen,etal。Expression of cathepsin B, H, and L and their inhiitors as markers of transitional cell carcinoma of the bladder[J]. Urology, 2004, 63(6)：1089-1094.

[11] 李開華，蔡宣松，梅炯,等.組織蛋白酶B在骨肉瘤中的表達及其與腫瘤侵襲轉移的關系[J].中國骨腫瘤骨病,2002,1(1)：43-45.

Expression of cathepsin B in bladder transitional cell carcinoma tissues and its correlation with the recurrence of carcinoma

TANG Shuo1，WEI Qiang2,WANG Anguo1,etal

(1.DepartmentofUrology,TheSecondClinicalHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,Sichuan,China;2.DepartmentofUrology，WestChinaHospital，SichuanUniversity，Chengdu610041，China)

Objective To evaluation the expression of cathepsin B in the transitional cell carcinorma of bladder (BTCC) and its correlation with the recurrence of carcinoma. Methods 172 tissues were collected from BTCC patients recurred for 3 times or more (3 times is contained) from 1994 to 2010. Immunohistochemical staining of CB in TCC and normal tissues was carried out by the streptavidin-biotin method. Results Immunohistochemistry stain demonstrated that the positive cells of cathepsin B was diffused in the cancer tissues with obvious stroma staining. The label index of BTCC tissues was obviously higher than that of normal tissues(P<0.01),and the label index is increased with the recurrence time(P<0.01). Conclusion The label index of high differentiation carcinoma is higher than that of low differentiation carcinoma. Cathepsin B staining of the normal bladder tissue is negative or only a few positive cells,but in the high grade and stage carcimoma tissues. The staining is positive and dispersed. Cathepsin B should be a good tool to determine the bladder tumor behavior and its prognosis.

Cathepsin B; Transitional cell carcinorma of bladder; Recurrence immunohistochemistry

南充市科技局資助項目(2010SF13)

李云祥，E-mail:liyunxiangwjsina.com

R 737.14

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.02.006

2014-10-10； 編輯： 張文秀)