二氫青蒿素抑制胰腺癌PANC-1細胞GLUT1表達的實驗研究*

溫桂海 王濤 朱濤

二氫青蒿素抑制胰腺癌PANC-1細胞GLUT1表達的實驗研究*

溫桂海1王濤1朱濤2

(1.邯鄲市中心醫(yī)院普外一科， 河北 邯鄲 056001；2.四川大學華西醫(yī)院， 成都 四川 610041)

目的 研究二氫青蒿素對胰腺癌PANC-1細胞的抑制作用和對GLUT1表達的調節(jié)作用及相關的信號通路。方法 使用不同濃度的二氫青蒿素(0μM、10μM和60μM)對胰腺癌PANC-1細胞進行干預。在不同時間點(0 h、24h和48h)使用MTT法對PANC-1細胞活性進行測定。在干預48h后，使用qPCR對二氫青蒿素干預的PANC-1細胞GLUT1 mRNA的表達水平進行測定。使用western blot對二氫青蒿素干預的PANC-1細胞GLUT1蛋白表達水平以及PI3K和Akt磷酸化水平進行測定。結果 使用不同濃度二氫青蒿素(0μM、10μM和60μM)對胰腺癌PANC-1細胞進行干預后，細胞活性呈時間依賴性和濃度依賴性下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。二氫青蒿素干預48h后，胰腺癌PANC-1細胞GLUT1 mRNA和蛋白的表達水平以及PI3K和Akt磷酸化水平水平呈濃度依賴性的下降，差異均存在統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。結論 本基礎研究提示二氫青蒿素可以通過調控PI3K/Akt信號通路的活化水平下調胰腺癌PANC-1細胞GLUT1 mRNA和蛋白的表達，并對腫瘤細胞的增殖有顯著抑制作用。該實驗結果為進一步二氫青蒿素應用于胰腺癌等腫瘤的臨床治療奠定了一定的基礎。

二氫青蒿素； 胰腺癌； PANC-1細胞； 葡萄糖轉運蛋白1； PI3K； Akt

胰腺癌(pancreatic cancer)是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，約占人類腫瘤發(fā)病率的2%左右，其中以導管細胞腺癌(duct cell carcinoma)最為常見[1-5]。由于胰腺解剖位置較深不易直接觸及和發(fā)現(xiàn)，致使大多數(shù)胰腺癌患者就診時已處于腫瘤的中晚期，多數(shù)以喪失根治性手術的時機。流行病學調查研究顯示胰腺癌的5年生存率僅在15%～25%[1-5]。同時近期的臨床研究發(fā)現(xiàn)由于人口老齡化及吸煙等環(huán)境因素，致使我國胰腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1-5]。二氫青蒿素(dihydroartemisinin, DHA)是抗瘧疾藥青蒿素(Artemisinin)的衍生物，其同樣具有顯著的抗瘧疾的藥理價值。近期的研究發(fā)現(xiàn)除抗瘧外二氫青蒿素還具有抑制炎癥反應、抑制腫瘤增殖、分化、浸潤以及促進腫瘤細胞凋亡和自噬的生物活性[6-10]。同時進一步的研究顯示二氫青蒿素的抗腫瘤活性與調控PI3K/Akt信號通路密切相關[11-13]。本基礎研究的目的是探討二氫青蒿素對于胰腺癌PANC-1細胞增殖的影響及其相關的信號通路和分子機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料 PCR試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司；鼠抗人GLUT1抗體、鼠抗人phospho-PI3K抗體、鼠抗人PI3K抗體、鼠抗人phospho-Akt抗體、鼠抗人Akt抗體和鼠抗人β-actin抗體購于美國Santa Cruz公司；二氫青蒿素購買于美國Sigma-Aldrich公司；DMEM培養(yǎng)基購買于美國Gibco公司；小牛血清購買于美國Hyclone公司；MTT試劑盒購買于美國Promega公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 胰腺癌PANC-1細胞常規(guī)接種在含10% FBS、100g/L 青霉素、100 g/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、95%空氣、5% CO2孵箱內培養(yǎng)。每48 h換液、傳代1次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3 細胞活性檢測 取對數(shù)生長期細胞消化制成單細胞懸液，接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔接種100 μL約含5×103個細胞。貼壁后無血清培養(yǎng)細胞16h至24h，使細胞同步化。加入不同終濃度(0μM、10μM和60μM)的二氫青蒿素，在37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)細胞，0μM二氫青蒿素干預組細胞作為對照組(Control組)。使用MTT比色試驗對不同時間點(0h、24h和48 h)的細胞生長狀態(tài)進行測定，實驗重復4次。對應時間點的細胞活性(%)=(OD干預組/OD對照組)×100 (%)[14]。

1.4 細胞GLUT1 mRNA表達檢測 按照試劑盒說明書提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行qPCR反應。GLUT1正義 5′-CTTTG TGGCCTTCT TTGAAGT-3′，反義5′-CCACAC AGTTG CTCCACAT-3′；β-actin正義：5′-TGGCA TTGCCG ACAG GAT-3′，反義：5′-GCTCAGGAG GAGCAAT GATCT-3′。使用β-actin作為內參基因，使用2-ΔΔCT公式計算目的基因相對表達量。ΔΔCt= (Ct，目標-Ct,β-actin)干預組-(Ct，目標-Ct,-actin)對照組[15]。

1.5 Western blot法檢測細胞GLUT1蛋白表達水平以及PI3K和Akt磷酸化水平 按照試劑盒操作要求，首先提取細胞總蛋白，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1h，分別加入鼠抗人GLUT1抗體、鼠抗人phospho-PI3K抗體、鼠抗人PI3K抗體、鼠抗人phospho-Akt抗體、鼠抗人Akt抗體和鼠抗人β-actin抗體，4℃孵育過夜，洗膜后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗(1: 2000)，用ECL進行顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)進行掃描。

1.6 統(tǒng)計學方法 計量資料以均數(shù)±標準差表示。采用SPSS 21.0進行單因素方差分析，兩樣本均數(shù)多重比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MTT法結果分析 在不同濃度(0μM、10μM和60μM)二氫青蒿素(DHA)干預后，使用MTT法對不同時間點(0h、24h和48h)胰腺癌PANC-1細胞活性進行測定。發(fā)現(xiàn)與未干預細胞(0μM DHA)相比較，給予二氫青蒿素干預的胰腺癌PANC-1細胞活性呈濃度依賴性和時間依賴性下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，見表1。

表1 MTT比色法測定PANC-1細胞活性

注：對應時間點與0μM相比較 ①P<0.05;#對應時間點與10μM相比較 ②P<0.05

2.2 GLUT1 mRNA和蛋白的表達 在給予胰腺癌PANC-1細胞不同濃度(0μM、10μM和60μM)二氫青蒿素(DHA)干預48h后，使用qPCR和western blot法對PANC-1細胞GLUT1 mRNA和蛋白的表達進行檢測。與未干預細胞(0μM DHA)相比較，給予DHA干預的PANC-1細胞GLUT1 mRNA和蛋白表達水平呈濃度依賴性下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，見表2和圖1。

表2 胰腺癌PANC-1細胞GLUT1 mRNA和蛋白表達水平以及PI3K和Akt磷酸化水平

注：與0μM相比較 ①P<0.05;與10μM相比較 ②P<0.05

圖1 胰腺癌PANC-1細胞GLUT1蛋白表達的western blot結果

Figure 1 Western blot result of the protein expression of GLUT1 in pancreatic cancer PANC-1 cells

2.3 PI3K磷酸化水平 在給予胰腺癌PANC-1細胞不同濃度(0μM、10μM和60μM)二氫青蒿素(DHA)干預48h后，使用western blot法對細胞PI3K磷酸化水平(phospho-PI3K/total PI3K)進行檢測。與未干預細胞(0μM DHA)相比較，給予DHA干預后的PANC-1細胞PI3K磷酸化水平呈劑量依賴性降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，見圖2和表2。

圖2 胰腺癌PANC-1細胞PI3K磷酸化的western blot結果

Figure 2 Western blot result of the phosphorylation of PI3K in pancreatic cancer PANC-1 cells

2.4 Akt磷酸化水平 在給予胰腺癌PANC-1細胞不同濃度(0μM、10μM和60μM)二氫青蒿素(DHA)干預48h后，使用western blot法對細胞Akt磷酸化水平(phospho-Akt/total Akt)進行檢測。與未干預細胞(0μM DHA)相比較，給予DHA干預后的PANC-1細胞Akt磷酸化水平呈劑量依賴性降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見圖3和表2。

圖3 胰腺癌PANC-1細胞Akt磷酸化的western blot結果

Figure 3 Western blot result of the phosphorylation of Akt in pancreatic cancer PANC-1 cells

3 討論

胰腺癌(pancreatic cancer)是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤類型之一。據(jù)2008年世界衛(wèi)生組織(WHO)的數(shù)據(jù)顯示胰腺癌的全球新發(fā)病例約為28萬例，發(fā)病率約為3.9/10萬人，其發(fā)病率占總惡性腫瘤新發(fā)病例的2.2%[1-5, 16]。雖然胰腺癌的發(fā)病率僅位居惡性腫瘤發(fā)病率的第13位，但與此相對應的是每年約3.7/10萬的病死率，其占惡性腫瘤總死亡人數(shù)的3.5%，位居第8位[1-5, 16]。我國的流行病學數(shù)據(jù)顯示胰腺癌的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢[1-5, 16]。調查發(fā)現(xiàn)1990至2000年10年間我國的胰腺癌標準化死亡率從1.46/10萬增加至2.38/10萬[16]。且數(shù)據(jù)顯示胰腺癌的5年生存率僅15%～25%[1-5, 16]。同時研究表明胰腺癌的發(fā)病率上升與人口老齡化以及吸煙有顯著的相關性[1-5, 16]。另一方面由于胰腺器官解剖位置位于腹腔深部不易被觸及且胰腺癌缺乏特異性癥狀致使患者就診時多以處于疾病的發(fā)展期，多數(shù)已不適合根治性手術的治療。同時胰腺癌多數(shù)病理類型對于放化療的敏感性不佳。故發(fā)現(xiàn)一種新的治療藥物和方法對于胰腺癌的臨床治療將會有重要的價值和意義。

青蒿素(Artemisinin)是中草藥黃花蒿(Artemisia annua L)的主要藥理活性物質，其化學結構為一種內過氧化基團的倍半萜內酯化合物[17]。目前青蒿素及其衍生物包括二氫青蒿素(dihydroartemisinin, DHA)主要用于瘧疾的臨床治療和預防。但近期的大量研究發(fā)現(xiàn)二氫青蒿素還具有抑制炎癥反應、調節(jié)細胞免疫、抑制腫瘤細胞增殖、分化和侵襲、抑制腫瘤血管生成、促進腫瘤細胞凋亡和自噬以及抑制器官纖維化等多種生物活性[18-20]。二氫青蒿素可以有效的抑制博萊霉素誘導的大鼠肺組織炎癥反應和纖維化過程[18]；通過活化caspase-3有效的促進凋亡誘導膠質瘤干細胞(glioma stem cells, GSCs)的凋亡，抑制膠質瘤的增殖[19]；可以通過抑制腫瘤細胞的糖代謝過程抑制非小細胞肺癌A549細胞和PC-9細胞的增殖[20]。我們使用MTT法對細胞活性進行檢測后發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)與未干預細胞(0μM DHA)相比較，給予二氫青蒿素干預的胰腺癌PANC-1細胞活性呈濃度依賴性和時間依賴性下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。該結果表明二氫青蒿素對于胰腺癌PANC-1細胞的增殖過程有顯著的抑制作用。

近期的部分研究發(fā)現(xiàn)青蒿素等衍生物的抗炎癥和抗腫瘤等藥理活性與調控PI3K/Akt信號通路密切相關[11-13, 21]。Tan SS等的研究證實青蒿琥酯(Artesunate)可以通過下調PI3K/Akt信號通路有效抑制支氣管哮喘氣道平滑肌細胞的增殖[21]。鐘軒等的研究發(fā)現(xiàn)二氫青蒿素可以通過下調PI3K/Akt信號通路抑制胃癌SGC7901細胞的增殖和Cyclin D1的表達水平[13]。我們的研究發(fā)現(xiàn)在給予胰腺癌PANC-1細胞不同濃度(0μM、10μM和60μM)二氫青蒿素干預48h后，與未干預細胞(0μM DHA)相比較，給予二氫青蒿素干預后的PANC-1細胞PI3K和Akt磷酸化水平呈劑量依賴性降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。同時由于PI3K/Akt信號通路對于腫瘤細胞糖代謝密切相關的葡萄糖轉運蛋白1 (GLUT1)的表達具有關鍵的調節(jié)意義，且GLUT1的表達水平與腫瘤的增殖密切相關[22]。我們對GLUT1的表達進行分析后發(fā)現(xiàn)與未干預細胞(0μM DHA)相比較，給予二氫青蒿素干預的胰腺癌PANC-1細胞GLUT1 mRNA和蛋白表達水平呈濃度依賴性下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。該實驗結果表明二氫青蒿素可以通過下調PI3K/Akt信號通路有效抑制胰腺癌PANC-1細胞GLUT1的合成。

4 結論

二氫青蒿素可以通過調控PI3K/Akt信號通路的活化水平下調胰腺癌PANC-1細胞GLUT1 mRNA和蛋白的表達，并對腫瘤細胞的增殖有顯著抑制作用。該實驗結果為進一步探討將二氫青蒿素應用于胰腺癌等腫瘤的臨床治療奠定了一定的基礎。

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Dihydroartemisinin suppresses expression of GLUT1 through PI3K/Akt signal pathway in pancreatic cancer PANC-1 cells

WEN Guihai1, WANG Tao1, ZHU Tao2

(1.DepartmentofTheFirstGeneralSurgery,HandanCentralHospital,Handan056001,Hebei,China;2.TheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollage,Chengdu610000,China)

Objective To study the anti-tumor role of dihydroartemisinin (DHA) in pancreatic cancer PANC-1 cells and its involving signal pathway. Methods Three different concentrations (0μM, 10μM and 60μM) of DHA were obtained in our study. At different time points (0h, 24h and 48h), MTT assay was performed to analyze the cell viabilities of PANC-1 cells. QPCR was used to detect the mRNA expression of GLUT1. The protein expression of GLUT1 and activation (phosphorylation) of PI3K and Akt were explored by western blot. Results The cell viabilities of pancreatic cancer PANC-1 cells were concentration-dependently and time-dependently suppressed by DHA. Then, after 48 hours of interventions, we found that the mRNA and protein expression of GLUT1 and the phosphorylation of PI3K and Akt were all concentration-dependently attenuated by DHA in pancreatic cancer PANC-1 cells. Conclusion Dihydroartemisinin (DHA) could inhibit the tumor proliferation and reduce the expression of GLUT1 possibly by inactivation of PI3K/Akt signal pathway in pancreatic cancer PANC-1 cells.

Dihydroartemisinin; Pancreatic cancer; PANC-1 cells; GLUT1; PI3K; Akt

中國博士后科學基金(2014M552369)

R 73-34

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.02.008

2015-09-17； 編輯： 張文秀)