心肌球源性干細(xì)胞對急性心肌梗死的治療作用及機(jī)制*

岳榮川 廖翔 王偉 羅瑜 楊德忠 張榮驛 劉思 劉杰 曾春雨

心肌球源性干細(xì)胞對急性心肌梗死的治療作用及機(jī)制*

岳榮川1廖翔2王偉2羅瑜1楊德忠2張榮驛1劉思1劉杰1曾春雨2

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科， 四川 南充 637000； 2.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院心血管內(nèi)科, 重慶 400042)

目的 探討心肌球源性干細(xì)胞(cardiosphere-derived cells，CDCs)在急性心肌梗死模型中的保護(hù)作用及機(jī)制。方法 建立心肌球源性干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，將成年的SD大鼠隨機(jī)分為3組：對照組(假手術(shù))、心梗組(通過結(jié)扎冠狀動脈前降支建立大鼠心肌梗死模型并向梗死區(qū)域周圍心肌內(nèi)注射PBS)和CDCs+心梗組(通過結(jié)扎冠狀動脈前降支建立大鼠心肌梗死模型并向梗死區(qū)域周圍心肌內(nèi)注射CDCs)。檢測各組心肌組織中活化的caspase-3蛋白表達(dá)水平，通過TUNEL染色檢測心肌組織中細(xì)胞凋亡情況，通過TTC染色檢測各組心肌梗死面積的差異。結(jié)果 心肌梗死以后心肌組織中活化的caspase-3蛋白表達(dá)水平、凋亡細(xì)胞數(shù)目及心肌梗死面積均明顯增加，而通過向梗死心肌邊緣區(qū)域注射CDCs能使活化的caspase-3 蛋白表達(dá)水平顯著降低，凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯減少，心肌梗死面積明顯減小(均P<0.05)。結(jié)論 CDCs可以通過抑制心肌細(xì)胞凋亡，減小梗死面積，從而對大鼠急性心肌梗死起到保護(hù)作用。

心肌球源性干細(xì)胞； 急性心肌梗死； 凋亡

心血管疾病是人類健康的第一殺手，隨著經(jīng)濟(jì)社會的發(fā)展和人口老齡化，我國心血管疾病的患病率持續(xù)增加，心肌梗死的發(fā)生率也日益升高[1]。心肌梗死導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡和壞死，大量心肌細(xì)胞的丟失會引起一系列復(fù)雜的病理過程并最終導(dǎo)致心力衰竭。目前的介入或藥物等治療方法只能延緩心力衰竭的進(jìn)展，而無法徹底恢復(fù)受損的心臟功能[2]。隨著新的心肌再生理論的發(fā)展，干細(xì)胞移植已成為治療心肌梗死的新策略[3]。近年已有多種干細(xì)胞被嘗試用于治療心肌梗死，如誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPS)、骨髓干細(xì)胞(bone marrow stem cells, BMCs)、胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell, ESC)等，雖然研究證實(shí)這些干細(xì)胞可以顯著提高心臟功能，改善心室重塑，但也同時存在免疫排斥反應(yīng)、生存率低、潛在致瘤性等不足[4, 5]。因此，探索新的干細(xì)胞治療策略已成為目前研究的熱點(diǎn)問題。

心肌球源性干細(xì)胞(cardiosphere-derived cells，CDCs)是從心肌組織中獲得的一種具有多向分化潛能的心肌細(xì)胞，在哺乳動物出生早期心房中的含量最多。因?yàn)榫哂袩o免疫排斥反應(yīng)、良好的心肌分化潛能、低致瘤性、容易獲得、易成活等特點(diǎn)，在心肌梗死治療領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。已有研究表明，CDCs能夠明顯改善心肌梗死后的心臟功能[6, 7]，并認(rèn)為其發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制主要與其向心肌細(xì)胞及血管細(xì)胞的分化有關(guān)，因此治療時機(jī)一般選在急性心肌梗死后的第3天。然而其發(fā)揮治療作用的機(jī)制是否與其前期的抗凋亡作用有關(guān)目前還不清楚，需要進(jìn)一步地研究證實(shí)。此問題的闡釋將有助于進(jìn)一步深入了解CDCs發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制并優(yōu)化心肌梗死后CDCs的治療時機(jī)。為此，在本實(shí)驗(yàn)中我們成功建立了CDCs培養(yǎng)方法，并在急性心肌梗死發(fā)生后立即向心肌組織中注射體外培養(yǎng)的CDCs，48小時以后觀察心肌組織中活化的caspase-3蛋白的表達(dá)、心肌細(xì)胞凋亡率以及心肌梗死面積等指標(biāo)，以明確CDCs是否可以通過發(fā)揮急性期抗凋亡作用而縮小心肌梗死后的梗死面積。

1 材料與方法

1.1 CDCs的培養(yǎng)方法 我們綜合現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道[8～10]，在實(shí)踐中不斷摸索和調(diào)整，并在細(xì)節(jié)上進(jìn)行了優(yōu)化和改進(jìn)，摸索出了本文所述的CDCs培養(yǎng)方法如下。

1.1.1 物品準(zhǔn)備 CGM培養(yǎng)基(按65%DMEM-F12/35%IMDM比例混合液中含7%胎牛血清，0.1 mmol/L巰基乙醇，10 ng/ml表皮生長因子，20 ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子，40 nmol/L心肌營養(yǎng)素，40 nmol/L凝血酶，100U/ml青霉素，100 μg/ml 鏈霉素，2 mmol/L L-谷氨酰胺)；CEM培養(yǎng)基(IMDM培養(yǎng)基中含有20%胎牛血清，100U/ml青霉素，100 μg/ml 鏈霉素，2 mmol/L L-谷氨酰胺，0.1 mmol/L巰基乙醇)；0.2%胰蛋白酶；0.1%膠原酶IV；無鈣鎂離子的PBS；0.53 mmol/L EDTA；2mg/ml多聚賴氨酸，1 μg/ml層粘連蛋白，4 μg/ml纖維蛋白連接素。

1.1.2 心肌組織的接種與培養(yǎng) 將剪成小塊的大鼠心肌組織用0.2%胰蛋白酶和0.1%膠原酶IV的混合液消化1分鐘(37℃)，在CEM培養(yǎng)基中進(jìn)一步將組織塊剪碎，然后將細(xì)小的心肌組織接種于用層黏連蛋白包被過的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，向培養(yǎng)皿中加入適量CEM培養(yǎng)基后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24小時后補(bǔ)充CEM培養(yǎng)基，之后每兩天更換一次培養(yǎng)基。

1.1.3 心肌組織來源的細(xì)胞收集與接種 接種于CEM培養(yǎng)基中的心肌組織會爬出兩種細(xì)胞，一種細(xì)胞呈扁平狀，緊貼于細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部向周圍擴(kuò)散；另一種為小圓細(xì)胞，分布在心肌組織移植物周圍貼敷于扁平細(xì)胞之上。用0.05%的胰蛋白酶及0.53 mmol/L EDTA將小圓細(xì)胞消化下來，用培養(yǎng)基中和消化，用200目濾網(wǎng)過濾以后將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105/ml后接種于用0.2 mg/ml多聚賴氨酸包被過的24孔板中，觀察心肌球的形成情況。

1.1.4 心肌球的收集與接種 將收集的小圓細(xì)胞接種于多聚賴氨酸包被過的細(xì)胞培養(yǎng)皿后3天左右會觀察到心肌球的形成，用培養(yǎng)基及PBS反復(fù)輕輕吹打使心肌球脫落后收集于離心管中。然后將心肌球接種于用4μg/ml纖維蛋白連接素包被過的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。

1.1.5 CDCs的獲得與傳代 接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的心肌球會逐漸向周圍爬出大量的細(xì)胞就是我們要得到的CDCs，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶長滿以后就可以進(jìn)行傳代，我們將第2代至第6代的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)之中。

1.2 心梗模型的建立及干細(xì)胞移植

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(180～200 g)由第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。動物的飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)遵守第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理和使用規(guī)定并遵循中國實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例(1998 年衛(wèi)生部第 55 號文件)。實(shí)驗(yàn)動物自由進(jìn)食、飲水，飼養(yǎng)于定濕、定溫的動物室內(nèi)，實(shí)驗(yàn)前禁食 12小時，實(shí)驗(yàn)在室溫條件下進(jìn)行。

1.2.2 心梗模型建立 按我們之前的實(shí)驗(yàn)方法[11]，通過腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)將大鼠麻醉，給予呼吸機(jī)支持呼吸，胸前備皮，用碘酒、酒精消毒手術(shù)區(qū)皮膚，于左側(cè)胸前第四五肋間剪開皮膚(橫向)約3厘米，剪肋間第一二層肌肉，稍加分離，鈍性分離肋間第三層肌肉，上開胸器暴露心臟，分開心包膜，于左心耳下2～3毫米處結(jié)扎冠狀動脈左前降支，結(jié)扎后可見左心室前壁組織由紅色變?yōu)辄S白色證明結(jié)扎成功；如顏色未變，需重新結(jié)扎1次。選擇缺血區(qū)域周圍的4個部位，向心肌中注射CDCs(將2 × 106個CDCs混懸于100 μl PBS中)或等量PBS。

1.3 estern blot檢測激活的caspase-3蛋白表達(dá) 心梗48小時后，根據(jù)我們之前的方法提取壞死周邊區(qū)域心肌組織蛋白[11, 12]，按BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度并將蛋白定量、分裝。取等量蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳后將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用脫脂奶粉封閉2 小時，分別加入caspase-3 單克隆抗體和內(nèi)參照蛋白GAPDH，4℃孵育過夜，洗膜后加入與一抗相匹配的二抗，室溫下避光孵育1 小時，再次洗膜后利用ODYSSEY-紅外凝膠掃描系統(tǒng)掃描NC膜顯示條帶，通過條帶的灰度值進(jìn)行定量分析。

1.4 心肌組織TUNEL染色 心梗手術(shù)48小時后將心臟取出，置于4%多聚甲醛溶液中繼續(xù)固定24 小時。將固定后的組織進(jìn)行梯度脫水后石蠟包埋。然后做組織切片，參照我們之前的實(shí)驗(yàn)方法[13, 14]，用末端脫氧核苷酰基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)性dUTP切口末端標(biāo)記(TUNEL)和DAPI共染色的方法檢測壞死周邊區(qū)域心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生情況。

1.5 TTC染色計(jì)算心肌梗死面積 參照我們之前的實(shí)驗(yàn)方法[11]，先用PBS配制1%的TTC溶液置于冰上避光備用，心梗手術(shù)48小時以后將心臟迅速取出，放在-80℃冰箱中冷凍10分鐘，然后用刀片自心尖至心底依次垂直于長軸橫切成1 mm左右的心肌片段，接著將心肌片浸入1%TTC溶液中，放入37℃恒溫箱中孵育10 分鐘，再用4%多聚甲醛固定8小時，最后照相，統(tǒng)計(jì)心肌梗死面積。

2 結(jié)果

圖1 大鼠心肌球接種及CDCs的擴(kuò)增方法

Figure 1 Specimen processing for rat cardiosphere growth and CDC expansion

2.1 大鼠心肌球接種及CDCs的培養(yǎng) 大鼠的心臟取出(圖1A)后置于冰的PBS液中，將心肌組織剪碎后種植于鋪有層黏連蛋白處理過的細(xì)胞培養(yǎng)皿中(圖1B)，7天后可見到心肌組織會爬出兩種細(xì)胞，一種細(xì)胞呈扁平狀，緊貼于細(xì)胞培養(yǎng)皿底部向周圍擴(kuò)散，另一種為小圓細(xì)胞，分布在心肌組織移植物周圍貼敷于扁平細(xì)胞之上(圖1C、D)，將小圓細(xì)胞收集后接種于多聚賴氨酸包被過的細(xì)胞培養(yǎng)板后3天左右會觀察到心肌球的形成(圖1E、F)，將心肌球細(xì)胞收集種于用纖維蛋白連接素包被過的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中(圖G)，4天后可以看到從心肌球擴(kuò)增出大量的細(xì)胞(圖H)，就是我們所需要的CDCs。

2.2 活化的caspase-3蛋白表達(dá)水平的變化 由圖2中Western Blot的結(jié)果可見，與對照組(0.05±0.02)相比，行心肌梗死手術(shù)大鼠心肌組織中活化的caspase-3蛋白的表達(dá)水平(0.24±0.04)明顯升高(P<0.05)。而心肌梗死后注射CDCs能使心肌組織中活化的caspase-3蛋白的表達(dá)水平明顯降低(0.14±0.02)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 不同組心肌組織中細(xì)胞凋亡率的變化 我們通過TUNEL染色對不同處理大鼠心肌組織中的細(xì)胞凋亡率進(jìn)行檢測。與對照組(0.7±1.2%)相比，心肌梗死組大鼠心肌組織中TUNEL陽性細(xì)胞比例[(16.3±2.1)%]明顯增加(P<0.05)。然而心肌梗死后注射CDCs能使心肌組織中TUNEL陽性細(xì)胞比例明顯下降[(9.1±2.1)%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

圖2 CDCs對活化的caspase-3蛋白水平的影響

Figure 2 The effects of CDCs on protein levels of activated caspase-3

注：n=6, 與對照組比較，①P<0.05 ； 與心梗組比較，②P<0.05

圖3 CDCs對心梗后心肌中TUNEL陽性細(xì)胞比例的影響

Figure 3 The effects of CDCs on the rate of TUNEL positive cells in myocardial tissue

注：n=6, 與對照組比較，①P<0.05 ； 與心梗組比較，②P<0.05

2.4 不同組心肌梗死面積的比較 與對照組[(0±0)%]相比，行心梗手術(shù)組的大鼠心肌的梗死面積[(27.2±5.5)%]明顯增加(P<0.05)。與單純心肌梗死組相比，心梗手術(shù)后立即注射CDCs組的大鼠的心肌梗死面積[(17.8±5.7)%]明顯減小(P<0.05，圖4)。

圖4 CDCs對心梗后心肌梗死面積的影響

Figure 4 The effects of CDCs on infarct size after myocardial infarction

注：n=6, 與對照組比較，①P<0.05 ； 與心梗組比較，②P<0.05

3 討論

心肌梗死以后的病理過程主要分為兩個階段，急性期主要以大量的心肌細(xì)胞凋亡或壞死為主，而在代償期會不可逆地發(fā)生心肌組織重構(gòu)，重構(gòu)過程一般在心梗以后1周開始，4周左右逐漸趨于穩(wěn)定[15, 16]。再灌注策略的主要目的是在急性期盡可能挽救心肌，減少心肌細(xì)胞的凋亡和壞死，很多藥物治療的目的則是基于延緩心肌重構(gòu)的進(jìn)程[16]。

新興的干細(xì)胞治療策略寄希望于干細(xì)胞能夠分化成為心肌細(xì)胞、血管細(xì)胞等以實(shí)現(xiàn)心肌再生，從根本上抑制心肌重構(gòu)的進(jìn)程。同時也有另外的觀點(diǎn)認(rèn)為，植入的干細(xì)胞向心肌細(xì)胞及血管細(xì)胞的分化能力有限，其改善心臟功能的作用主要與其旁分泌的作用有關(guān)(通過旁分泌因子到周圍組織，發(fā)揮保護(hù)作用)[17～19]。

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，成年心肌組織是不可再生的，心臟不能進(jìn)行內(nèi)源性的修復(fù)。然而近年來科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了心臟干細(xì)胞的存在，可以向心肌、內(nèi)皮及平滑肌分化[20]。Messina E等[8]率先將心臟組織塊進(jìn)行培養(yǎng)，之后收集向外生長的小圓細(xì)胞，將這些收集的細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)，獲得球樣成簇的細(xì)胞團(tuán)，稱為心肌球，然后將心肌球放置于鋪有纖維連接蛋白的培養(yǎng)瓶中進(jìn)一步培養(yǎng)，向外生長的細(xì)胞稱為CDCs。CDCs具有多項(xiàng)分化潛能，并且具有無免疫排斥反應(yīng)、良好的心肌分化潛能、低致瘤性、容易獲得等特點(diǎn)。因此，被認(rèn)為是一種治療心血管疾病頗有前景的心臟干細(xì)胞。既往已經(jīng)有研究證明其對心肌梗死具有治療作用，但目前的研究方向主要集中于其向心肌細(xì)胞及血管細(xì)胞的分化能力上，其保護(hù)作用是否與抗凋亡作用有關(guān)，目前還不清楚[21, 22]。為了進(jìn)一步明確其對心肌梗死的保護(hù)作用是否與改善急性期的心肌細(xì)胞凋亡與壞死有關(guān)，我們在國內(nèi)率先成功建立了CDCs的培養(yǎng)方法，并在心肌梗死后立即向缺血心肌周圍注射培養(yǎng)的CDCs，觀察其對急性期心肌梗死是否具有保護(hù)作用。

我們對心肌組織中活化的caspase-3蛋白表達(dá)水平、心肌細(xì)胞凋亡以及心肌梗死面積進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)心肌梗死后立即向梗死心肌周圍組織注射CDCs能使心肌組織中caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯降低，使心肌組織中的凋亡細(xì)胞比例明顯降低，最終使心肌梗死面積明顯減小。

4 結(jié)論

CDCs可以通過抑制急性心肌梗死后引起的心肌細(xì)胞凋亡來減小心肌梗死面積,從而對心肌梗死起到保護(hù)作用。

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Cardiosphere-derived cell therapy for treatment of acute myocardial infarction

YUE Rongchuan, LIAO Xiang,WANG wei,etal

(1.DepartmentofCardiology，NorthSichuanMedicalCollegeAffiliatedHospital，Nanchong637000,Sichuan,China;2.DepartmentofCardiology,DapingHospital,TheThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China)

Objective To investigate the protective role and mechanism of cardiosphere-derived cells (CDCs) in acute myocardial infarction. Methods CDCs were got from rat heart tissue. Adult male SD rats were divided into control group, MI group (LAD was permanently ligated and CDCs+MI group (CDCs were injected into 4 regions within ischemic border zone after LAD was permanently ligated). Then, the protein level of activated caspse-3, the apoptosis rate of myocardial cells, and the infarct area of the heart were determined in these groups. Results Compared with control, the protein level of activated caspse-3, the apoptosis rate of myocardial cells, and the infarct area of the heart were significantly increased in the MI groups (P<0.05). However, these effects were abolished by CDCs treatment(P<0.05). Conclusion CDCs were suggested to be a promising cell source to repair acute myocardial infarction through inhibiting apoptosis.

Cardiosphere-derived cells; Acute myocardial infarction; Apoptosis

國家自然科學(xué)基金(81100111)

王偉，E-mail: 13883117310@163.com

R -33;R 542.2+2

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.03.008

2015-12-01； 編輯： 母存培)