丹參多酚保護線粒體功能減輕H2O2誘導的成年小鼠心肌細胞損傷*

冉斌 岳榮川 胡厚祥 張榮驛 劉思 劉杰 陳海燕 譚春燕

丹參多酚保護線粒體功能減輕H2O2誘導的成年小鼠心肌細胞損傷*

冉斌1,2岳榮川1胡厚祥1張榮驛1劉思1劉杰1陳海燕1譚春燕1

( 1. 川北醫學院附屬醫院心內科, 四川 南充 637000 ；2. 江油市人民醫院心內科, 四川 江油 621700)

目的 探討丹參多酚減輕心肌細胞損傷的作用及機制。方法 將原代培養的成年小鼠心肌細胞分為4組：對照組(換MEM細胞培養液)、丹參多酚組(用含有5g/L丹參多酚的MEM細胞培養液處理細胞3小時)、H2O2組(用含有25 μM H2O2的MEM細胞培養液處理細胞3小時來誘導成年小鼠心肌細胞的損傷)及丹參多酚+H2O2組(用同時含有5g/L丹參多酚及25 μM H2O2的MEM細胞培養液處理細胞3小時)。檢測4個不同處理組中細胞活力、細胞內ATP水平、線粒體體膜電位的變化。結果 與對照組相比，H2O2組中的細胞存活率明顯下降，細胞內ATP水平顯著降低，線粒體膜電位也明顯下降(均P<0.05)。而丹參多酚能明顯抑制H2O2引起的細胞存活率下降、細胞內ATP水平的降低以及線粒體膜電位的下降(均P<0.05)。 結論 丹參多酚可以對心肌細胞起到保護作用，其發揮保護作用的機制可能與其減輕線粒體功能障礙有關。

丹參多酚； 成年小鼠心肌細胞； 線粒體功能

心血管疾病已經成為影響人類健康的第一位疾病，且其發病率仍然呈現逐年上升的趨勢[1]。心肌細胞的凋亡與壞死導致的心肌細胞丟失是多種心血管疾病發生的共同病理生理機制[2]。成年心肌細胞被認為是一種自我再生能力極低的細胞，一旦丟失往往難以得到有效的補充[3]。因此，如何積極有效地保護心肌細胞免于各種病理損傷一直是國內外學者致力于研究的熱點問題。

傳統的中藥丹參多酚在中國已經廣泛而成功地應用于治療各種心腦血管疾病[4～6]，但其確切機制仍不清楚，需要進一步研究。前期研究發現，線粒體功能障礙是細胞走向凋亡的重要的共同途徑[7, 8]。因此我們推測，丹參多酚的保護作用可能與其減輕線粒體功能障礙從而抑制細胞凋亡有關。為了驗證這一推測，我們用H2O2處理成年心肌細胞，造成細胞損傷，觀察丹參多酚是否對損傷的心肌細胞具有直接的保護作用，同時通過檢測細胞內ATP水平及線粒體膜電位等指標，觀察丹參多酚的保護作用是否與減輕線粒體功能障礙有關。

1 材料與方法

1.1 成年小鼠心肌細胞培養 根據我們之前的方法[9]分離和培養成年小鼠心肌細胞：取出小鼠心臟后立即采用主動脈逆灌注方法灌流緩沖液，然后灌流消化酶消化分離細胞，梯度復鈣，細胞預貼壁1小時后，換培養液在37℃ 2%CO2培養箱中培養24小時換液。

1.2 細胞分組 分離的成年小鼠心肌細胞隨機分成4組：① 對照組：更換MEM細胞培養液，3小時(37℃)后檢測相應的指標。② 丹參多酚組：更換含有5g/L丹參多酚[10]的MEM細胞培養液，3小時(37℃)后檢測相應的指標。③ H2O2組：更換含有25 μM H2O2的MEM細胞培養液[9]，3小時(37℃)后檢測相應的指標。 ④ 丹參多酚+H2O2組：更換同時含有5g/L丹參多酚[10]及25 μM H2O2的MEM細胞培養液，3小時(37℃)后檢測相應的指標。

1.3 細胞中ATP水平檢測 細胞中ATP水平是反應線粒體功能的一項重要指標。根據我們之前實驗方法[11, 12]，按ATP檢測試劑盒操作步驟進行檢測。以對照組作為標準，進行相對量的比較。

1.4 細胞中線粒體膜電位檢測 根據我們之前的實驗方法[11, 12]，用JC-1探針檢測線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質中，形成聚合物，產生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-1 不能聚集在線粒體的基質中，此時JC-1為單體，產生綠色熒光。具體步驟按照試劑盒說明書進行，染色結束立即于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照，同時通過多功能酶標儀檢測綠光(490/530 nm)和紅光(525/590 nm)吸光值進行定量比較。

2 結果

2.1 丹參多酚對成年小鼠心肌細胞存活率的影響 采用H2O2處理成年小鼠心肌細胞來模擬心肌細胞損傷的體外模型，可以看到H2O2會引起細胞死亡(桿狀細胞為活細胞，蜷縮成團狀細胞為死細胞，圖1)。與對照組比較[(87.4±2.6)%]，H2O2組細胞存活率[(46.6±3.6)%]明顯降低(P<0.05)，而加入丹參多酚[(68.6±3.2)%]能明顯增加細胞對H2O2損傷的耐受(P<0.05)。

圖1 丹參多酚對成年小鼠心肌細胞的保護作用

Figure 1 The protective effects of salvianolate on adult mice cardiomyocytes

注：n=6, 與對照組比較，①P<0.05；與H2O2組比較，②P<0.05

2.2 丹參多酚對成年小鼠心肌細胞內ATP水平的影響 細胞內ATP水平是反應細胞線粒體功能的重要指標，用H2O2處理成年小鼠心肌細胞后，我們可以看到細胞內的ATP水平[(46.5±4.2)%]較對照組(100%)明顯降低(P<0.05)，說明氧化應激引起了線粒體功能障礙，而加入丹參多酚[(68.7±4.8)%]能明顯抑制H2O2引起ATP水平的下降(P<0.05)，圖2。

圖2 丹參多酚抑制H2O2引起的心肌細胞內ATP水平的下降

Figure 2 Salvianolate prevented the reduction of ATP in cardiomyocytes induced by H2O2

注：n=6, 與對照組比較，①P<0.05 ； 與H2O2組比較，②P<0.05

圖3 丹參多酚抑制H2O2引起的線粒體膜電位下降

Figure 2 Salvianolate prevented the reduction of mitochondrial membrane potential induced by H2O2

注：n=6, 與對照組比較，①P<0.05； 與H2O2組比較，②P<0.05

2.3 丹參多酚對成年小鼠心肌細胞線粒體膜電位的影響 線粒體膜電位是反應線粒體功能的重要指標，我們通過JC-1探針來檢測線粒體膜電位的變化。激光共聚焦顯微鏡下可以看到H2O2處理組中成年心肌細胞的紅色熒光減弱，綠色熒光增強；用酶標儀測各組紅光與綠光比值并與對照組比較也明顯降低，說明H2O2處理組細胞中線粒體膜電位[(35.6±5.1)%]與對照組(100%)相比明顯降低(P<0.05)。而加入丹參多酚后通過激光共聚焦顯微鏡可以看到細胞的紅色熒光較雙氧水組增強，綠色熒光較H2O2組減弱。用酶標儀檢測各組紅光與綠光比值發現，加入丹參多酚后線粒體膜電位[(60.0±7.2)%]較H2O2組[(35.6±5.1)%]明顯升高(P<0.05)。

3 討論

傳統中藥丹參多酚在中國被廣泛應用于治療各種心腦血管疾病，如冠心病[4]、腦梗死[13]等。多項實驗研究也證實其在心血管疾病中的保護作用。Han B等的研究結果表明，丹參多酚能夠減輕豬心肌的缺血/再灌注損傷[14]。Meng C等的研究結果表明，丹參多酚能夠通過調節炎癥減輕大鼠的動脈粥樣硬化[15]。另有研究表明，丹參多酚能夠減輕豬急性心肌梗死后氧化應激指標，降低腦鈉肽的水平[16]。這些數據充分證明丹參多酚對心臟的保護作用，但其具體的保護機制仍不是很清楚。

線粒體功能障礙引起的心肌細胞凋亡是心血管疾病中多種病理生理變化的共同途徑[17～19]。心肌細胞再生能力極低，心肌細胞凋亡導致有效的心肌細胞丟失，最終會導致心臟重塑及心衰的發生[3, 20]。因此如何有效保護線粒體功能，減少心肌細胞凋亡，從而最大限度地減少心肌細胞的丟失，對于延緩心衰的進展具有重要意義。有研究表明，丹參多酚具有抗氧作用[10, 16, 21]，因此它可能會通過減輕氧化應激對線粒體功能起到保護作用。

在本實驗中，我們通過H2O2刺激對體外培養的成年小鼠心肌細胞造成損傷，觀察丹參多酚的保護作用，發現丹參多酚可以有效減少H2O2引起的成年小鼠心肌細胞的死亡。說明丹參多酚可以直接對心肌細胞起到保護作用。同時為了進一步探討丹參多酚的保護機制，我們同時對各組心肌細胞中的ATP水平及線粒體膜電位進行檢測，發現丹參多酚可以抑制H2O2引起的心肌細胞內ATP水平的下降以及線粒體膜電位的降低，說明丹參多酚可以減輕H2O2引起的線粒體功能障礙，其對心肌細胞的保護作用與其減輕線粒功能障礙有關。但其保護線粒體功能的具體機制還有待于進一步深入研究。

4 結論與啟示

丹參多酚可以減輕H2O2引起的成年小鼠心肌細胞損傷，說明丹參多酚可以直接對心肌細胞發揮保護作用，其保護心肌細胞的作用與其能夠減輕線粒體功能障礙有關。

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Salvianolate protects against H2O2-induced adult mice cardiomyocytes injury by precenting mitochondrial dysfunction

RAN Bin，YUE Rongchuan,HU Houxiang,etal

(DepartmentofCardiology,NorthSichuanMedicalCollegeAffiliatedHospital，Nanchong637000,Sichuan,China;DepartmentofCardiology，JiangyouPeople’sHospital,Jiangyou621700,Sichuan,China)

Objective To investigate the protective role and mechanism of salvianolate on cardiac myocytes injury. Methods The primary cultured adult mouse cardiomyocytes were divided into control group, salvianolate group, cardiomyocytes exposed to MEM containing 5g/L salvianolate for 3 hours. H2O2group, cardiomyocytes exposed to MEM with 25μM H2O2for 3 hours and the salvianolate + H2O2group, cardiomyocytes were treated with MEM containing 5g/L salvianolate and 25μM H2O2. Then, the survival of cardiomyocytes was counted. The intracellular ATP and the mitochondrial membrane potential were determined in these groups. Results Compared with control, the survival of cardiomyocytes was significantly decreased and the intracellular ATP and mitochondrial membrane potential were also significantly decreased in the H2O2group(P<0.05). However, these effects of H2O2on cardiomyocytes were abolished by salvianolate (P<0.05). Conclusion Salvianolate could alleviate adult mice cardiomyocytes injury by preventing mitochondrial dysfunction.

Salvianolate； Adult mice cardiomyocytes； Mitochondrial function

國家自然科學基金(81070101)

胡厚祥，教授，本刊編委，E-mail：hhxiang17@163.com

R-33

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.03.006

2015-12-01； 編輯： 母存培)