富氫生理鹽水對心肌梗死后心肌重構的影響*

王強 楊永健 李德 彭柯 速曉華 唐良虎 楊大春 唐兵

富氫生理鹽水對心肌梗死后心肌重構的影響*

王強 楊永健 李德 彭柯 速曉華 唐良虎 楊大春 唐兵

(成都軍區總醫院心血管內科， 四川 成都 610083)

目的 觀察富氫生理鹽水對心肌梗死心肌重構的影響，并探討其可能機制。 方法 選用20 ～ 25 g的健康C57/BL6小鼠60只，隨機分為對照組、心肌梗死(MI)組和MI+富氫生理鹽水(HRS)組，21天后通過心臟超聲、多導生理記錄儀檢測心臟功能和血流動力學指標，病理染色觀察心肌梗死范圍、心肌肥厚和間質纖維化，并檢測梗死交界區心肌中氧化應激和炎癥反應情況。 結果 腹腔注射HRS可以明顯改善小鼠心肌梗死后心臟功能(P<0.01或P<0.05)，縮小心肌梗死面積(P<0.01)，抑制非梗死區的心肌細胞肥大和間質纖維化，增強心肌中超氧化物岐化酶活性，降低丙二醛、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β、白細胞介素-6、單核細胞趨化蛋白-1含量(P<0.01或P<0.05)。結論 HRS通過抑制心肌重構來改善小鼠心肌梗死后的心臟功能，可能與其減輕氧化應激、抑制過度炎癥反應有關。

心肌梗死； 心肌重構； 氫氣； 氧化應激； 炎癥反應

冠狀動脈粥樣硬化導致的心肌梗死(myocardial infarction, MI)是當今嚴重危害人類健康的疾病，盡管通過早期冠脈介入治療、溶栓治療等再灌注措施，有效地降低了MI的再梗死率及死亡率，但不能逆轉心肌梗死后的心肌重構(cardiac remodeling)；加之有相當數量的患者由于種種原因心肌組織不能得到及時、有效的再灌注，心肌難免最終壞死，形成梗死區，從而啟動心梗后心肌重構[1]。過去幾十年來心力衰竭、心肌重構的防治研究取得了長足進展，但基于抑制神經體液系統和輔助代謝優化療法的策略尚不能完全逆轉或抑制心肌重構[2]。2007年，日本學者Ohsawa I等發現，動物呼吸2%的氫氣可顯著改善腦缺血再灌注損傷，該研究迅速引起廣泛關注，并引起研究氫氣治療疾病的熱潮[3]。前期研究發現，將氫氣通過特殊處理可以制成含有濃度0.2～1.0 mmol/L氫氣的富氫生理鹽水(hydrogen-rich saline，HRS)，HRS可以明顯減輕急性的心肌缺血再灌注損傷[4, 5]。然而HRS對心肌梗死后心肌重構這一慢性病程的影響尚不清楚。本研究采用小鼠心肌梗死模型，觀察HRS對心肌梗死心肌重構的影響，并初步探討其可能機制，旨在為心肌梗死后心肌重構、心力衰竭的防治提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 主要材料 健康雄性C57/BL6小鼠60只，10～12周齡，體重20 ～ 25 g，購自成都達碩實驗動物有限公司，所有實驗嚴格按照實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)活性試劑盒購自南京建成生物工程研究所。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)、白細胞介素-6(interleukin 6，IL-6)、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)的ELISA檢測試劑盒購自美國eBioscience公司。

1.2 HRS的制備 按照筆者前期參與研究中的方法制備HRS[6]，將袋裝250 ml醫用生理鹽水抽出50 ml，加入50ml純凈的氫氣并充分混合，將含氫的生理鹽水置于0.4 MPa壓力下穩壓24小時，達到飽和狀態，制備HRS，使氫氣濃度保持在0.6 mmol/L左右，經輻照消毒滅菌于4℃保存備用。HRS需要每周制備以保證氫氣的濃度不低于0.6 mmol/L。

1.3 動物分組及干預 小鼠隨機分為3組：對照組、心肌梗死(MI)組和心肌梗死(MI)+HRS組，每組20只。按照課題組前期的方法建立小鼠心肌梗死模型[7]，小鼠麻醉后，在左側第3、4 肋間隙擠出心臟，左心耳下緣水平線為標志，在線下2 mm處以6-0絲線結扎冠狀動脈左前降支建立小鼠心肌梗死模型。HRS組于手術前3小時開始采用HRS [10 mg/(Kg·d)]腹腔注射小鼠，對照組和心肌梗死組采用生理鹽水腹腔注射，至實驗結束。

1.4 小鼠血流動力學、心臟功能的檢測 參照筆者前期的方法[8]，小鼠麻醉后，采用Visual Sonics小動物超聲診斷儀測定小鼠的左心室射血分數(eject fraction, EF)、左心室內徑縮短率(fractional shortening, FS)；采用多導生理記錄儀(PowerLab，澳大利亞AD Instruments公司)測定小鼠的血流動力學指標，仰臥位消毒、鋪巾，分離右頸動脈并插管，插管入左心室后記錄心室壓力曲線，根據Chart 5軟件計算左心室收縮期壓力(left ventricular end-systolic pressure, LVESP)、左心室舒張末期壓力(left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)、等容收縮期左室內壓力上升最大速率(+dP/dt)和等容舒張期左室壓力下降最大速率(-dP/dt)。實驗結束后處死小鼠，取出心臟標本，分別凍存于- 80℃冰箱和置于福爾馬林中固定。

1.5 心肌組織病理檢測 參照課題組前期的方法[9]，各組心肌組織經福爾馬林固定后，常規石蠟切片，行HE染色和Masson染色。用Image-Pro Plus系統進行圖像分析，測量出心肌梗死面積占總面積的百分比。

1.6 心肌組織中MDA、SOD、TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1水平測定 取左心室梗死交界區組織，用生理鹽水反復沖洗后置于勻漿器中，加入1 ml生理鹽水在冰浴中進行組織勻漿，勻漿液離心(3000 r/min, 5 min)，取上清液，用于檢測心肌組織中MDA、SOD、TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1水平。采用黃嘌呤氧化酶(羥胺)法檢測SOD活性，采用硫代巴比妥酸(TBA)法檢測MDA水平，采用酶聯免疫分析法(ELISA)分析TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2 結果

2.1 HRS對小鼠心肌梗死后心臟功能的影響 心肌梗死后第21天，心臟超聲和血流動力學檢測顯示，左心室腔明顯擴大，EF和FS顯著降低，LVESP減小，LVEDP明顯增加，+dP/dt明顯減小，-dP/dt明顯增加(P<0.01或P<0.05，表1)，提示小鼠心肌梗死模型建立成功。與MI組相比，HRS可導致心肌梗死小鼠的EF、FS、LVESP、+dP/dt明顯增加，LVEDP、-dP/dt明顯減小(P<0.01或P<0.05，表1)，提示HRS可以明顯改善小鼠心肌梗死后心臟的收縮和舒張功能。

Table 1 Effect of HRS on cardiac function after myocardial infarction in mice

指標對照組MI組MI+HRS組EF(%)53.62±3.6521.18±2.89②32.65±3.66④FS(%)26.79±1.9710.61±1.51②16.31±1.89③LVESP(mmHg)113.63±4.4296.50±4.97①102.25±4.78LVEDP(mmHg)1.78±0.3812.65±0.94②7.40±0.83③dP/dtmax(mmHg/s)4216±2171368±215②2539±325④dP/dtmin(mmHg/s)-3865±198-1151±206②-2016±259④

注：n=10；與對照組比較，①P<0.05，②P<0.01;與MI組比較，③P<0.05，④P<0.01

2.2 HRS對小鼠心肌梗死面積、心肌纖維化的影響 心肌梗死后第21天，通過Masson染色的方法測量心肌梗死面積，并評估心肌纖維化情況。與MI相比，HRS干預組的心肌梗死范圍明顯縮小[(38.42 ± 5.26)%vs(22.86±3.17)%，P<0.01，圖1]，梗死交界區、非梗死區膠原沉積減少，纖維化程度減輕，而梗死區發現有更多的存活心肌細胞(圖1)，提示HRS可以縮小心肌梗死面積，抑制心梗后心肌纖維化。

圖1 HRS對小鼠心肌梗死面積、心肌纖維化的影響

Figure 1 Effect of HRS on infarct area size and cardiac fibrosis after myocardial infarction in mice

2.3 HRS對小鼠非梗死區心肌肥厚的影響 心肌梗死后第21天，小鼠非梗死區心肌組織出現代償性心肌肥厚[心肌細胞面積：(408.5 ± 39.4) μm2vs(275.0±19.2) μm2，P<0.01，圖2]；與MI組相比，HRS干預組非梗死區心肌肥厚情況顯著改善[心肌細胞面積：(344.6±26.3) μm2vs(408.5±39.4) μm2，P<0.01，圖2]，提示HRS可以延緩非梗死區的心肌肥厚。

2.4 HRS對小鼠心肌梗死后心肌組織中氧化應激、炎癥反應的影響 通過測量梗死交界區組織中MDA含量、SOD活性來評估心肌組織中氧化應激的情況，心肌梗死后第5天，梗死交界區心肌組織中MDA含量明顯增加、SOD活性顯著降低(均P<0.01，圖3)；與MI組相比，HRS干預組梗死交界區心肌組織中MDA含量減少、SOD活性降低(P<0.01或P<0.05，圖3)，提示HRS可以減輕心肌梗死后心肌組織中的氧化應激。

通過測量梗死交界區組織中TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1來評估心肌組織中炎癥反應的情況，心肌梗死后第5天，梗死交界區心肌組織中TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1表達明顯增加(均P<0.01，圖3)；與MI組相比，HRS干預組梗死交界區心肌組織中TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1表達顯著減少(P<0.01或P<0.05，圖3)，提示HRS可以抑制心肌梗死后心肌組織中的炎癥反應。

圖2 HRS對小鼠非梗死區心肌肥厚的影響

Figure 2 Effect of HRS on cardiac hypertrophy in non-infarcted myocardium in mice

3 討論

氫是自然界最簡單的元素，氫氣是無色、無嗅、無味，具有一定還原性的雙原子氣體，學術界早期一直認為氫氣屬于生理性惰性氣體。2007年，日本學者Ohsawa I等發現，動物呼吸2%的氫氣可顯著改善腦缺血再灌注損傷，氫氣可選擇性中和羥自由基和亞硝酸陰離子，而后兩者是氧化應激損傷的最重要介質[3]。該研究迅速引起廣泛關注，并引起研究氫氣治療疾病的熱潮。2009年，Cai J等最早提出一種含有濃度0.2～1.0 mmol/L氫氣的HRS治療腦缺血導致的組織損傷和器官功能障礙，通過脫氣處理、低溫預處理、注入純氫氣、加壓助溶等步驟制備的HRS能明顯減少腦梗死面積，減輕組織損傷，減少神經組織細胞凋亡數量[10]。前期研究發現，HRS可以明顯減輕急性的心肌缺血再灌注損傷[4, 5]。然而HRS對心肌梗死后心肌重構這一慢性病程的影響尚不清楚。

圖3 HRS對小鼠心肌梗死后心肌組織中氧化應激、炎癥反應的影響

Figure 2 Effect of HRS on oxidative stress and inflammation of peri-infarct myocardium in mice

注：n=10；與對照組比較，②P<0.01，與MI組比較，①P<0.05

本研究中，我們通過建立小鼠心肌梗死模型發現，腹腔注射HRS可以明顯改善小鼠心肌梗死后心臟的收縮和舒張功能。心肌重構是心肌梗死后慢性心力衰竭的關鍵病理環節，主要表現為梗死區的擴展、非梗死區的心肌細胞肥大和間質異常纖維化，大量研究證實，抑制心肌重構可以明顯延緩心肌梗死后心力衰竭的發生發展過程[11]。本研究中我們發現，HRS可以縮小心肌梗死的范圍，可能與其抑制梗死區的擴展有關。此外，HRS還可以抑制非梗死區的心肌細胞肥大和間質纖維化。因此，HRS可以通過抑制心梗后心肌重構來改善小鼠心臟的收縮和舒張功能。

氧化應激是由于心肌缺血缺氧引起心肌細胞內的氧自由基生成增多和(或)清除能力降低，從而導致氧自由基在細胞內蓄積，過多的氧自由基導致脂質過氧化，造成細胞氧化損傷，從而引起心肌細胞損傷或凋亡；MDA是氧自由基攻擊細胞膜中多不飽和脂肪酸后生成的脂質過氧化產物，MDA水平間接反映體內脂質氧化及組織損傷程度；SOD在氧化與抗氧化平衡中起著關鍵作用，通過清除人體中超氧化物和H2O2，保護細胞生物膜結構和功能的穩定性。前期大量研究證實，氧化應激是心肌梗死后心肌重構的重要環節[12]。在本研究中我們發現，HRS使得心肌梗死交界區組織中的MDA減少，SOD活性增加，提示HRS可能通過減輕氧化應激水平來抑制心肌重構。

心肌梗死后迅速激活固有免疫產生強烈而短暫的炎癥反應，清除梗死區域死亡細胞和細胞外基質碎片，是心臟修復必須的過程。然而心肌梗死后過度的炎癥反應可導致心肌細胞損傷、壞死和凋亡，促使梗死范圍的擴展，參與了心肌重構、心力衰竭的發生發展過程[13]。既往研究證實，TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1介導的炎癥反應在心肌梗死后心肌重構的過程中發揮了重要作用[14]。本研究中我們發現，HRS可使心肌梗死交界區組織中的TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1的表達明顯減少，提示HRS可能通過減輕過度的炎癥反應來抑制心肌重構。

值得注意的是，HRS如何調節心肌梗死后的氧化應激和炎癥反應，是通過氫直接中和氧自由基，或者像另一氣體分子硫化氫(H2S)通過相應的分子靶點發揮作用[15]，目前尚不清楚。此外，HRS對大動物、人的心肌梗死后心肌重構、心力衰竭的防治效果亦期待進一步研究。

4 結論

本研究結果提示，HRS可通過抑制心肌重構來改善小鼠心肌梗死后的心臟收縮和舒張功能，可能與其減輕氧化應激、抑制過度炎癥反應有關。本研究結果為心肌梗死后心力衰竭的防治提供了新思路。

[1] Lüscher TF. Heart failure: the epidemic of the new century [J]. Eur Heart J, 2014, 35(48): 3389-3390.

[2]Shah AM, Mann DL. In search of new therapeutic targets and strategies for heart failure: recent advances in basic science [J]. Lancet, 2011, 378(9792): 704-712.

[3]Ohsawa I, Ishikawa M, Takahashi K,etal. Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals [J]. Nat Med, 2007, 13(6): 688-694.

[4]Sun Q, Kang Z, Cai J,etal. Hydrogen-rich saline protects myocardium against ischemia/reperfusion injury in rats [J]. Exp Biol Med (Maywood), 2009, 234(10): 1212-1219.

[5]Zhang Y, Sun Q, He B,etal. Anti-inflammatory effect of hydrogen-rich saline in a rat model of regional myocardial ischemia and reperfusion [J]. Int J Cardiol, 2011, 148(1): 91-95.

[6]Qin ZX, Yu P, Qian DH,etal. Hydrogen-rich saline prevents neointima formation after carotid balloon injury by suppressing ROS and the TNF-α/NF-κB pathway[J]. Atherosclerosis, 2012, 220(2): 343-350.

[7]Ye T, Wang Q, Zhang Y,etal. Over-expression of calpastatin inhibits calpain activation and attenuates post-infarction myocardial remodeling [J]. PLoS One, 2015, 10(3): e0120178.

[8]Wang Q, Ma S, Li D,etal. Dietary capsaicin ameliorates pressure overload-induced cardiac fibrosis and heart failure via the transient receptor potential vanilloid type 1 [J]. Am J Hypertens, 2014, 27(12): 1521-1529.

[9]王強，馬雙陶，楊大春，等. 腎交感神經去除術對心肌肥厚和心肌纖維化的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(11): 1993 -1997.

[10] Cai J, Kang Z, Liu K,etal. Neuroprotective effects of hydrogen saline in neonatal hypoxia-ischemia rat model [J]. Brain Res, 2009, 1256: 129-137.

[11] van Berlo JH, Maillet M, Molkentin JD. Signaling effectors underlying pathologic growth and remodeling of the heart[J]. J Clin Invest, 2013, 123(1): 37-45.

[12] Hori M, Nishida K. Oxidative stress and left ventricular remodelling after myocardial infarction[J]. Cardiovasc Res, 2009, 81(3): 457-464.

[13] Frangogiannis NG. The inflammatory response in myocardial injury, repair, and remodelling[J]. Nat Rev Cardiol, 2014, 11(5): 255-265.

[14] Huang W, Rubinstein J, Prieto AR,etal. Transient receptor potential vanilloid gene deletion exacerbates inflammation and atypical cardiac remodeling after myocardial infarction[J]. Hypertension, 2009, 53(2): 243-250.

[15] Kondo K, Bhushan S, King AL,etal. H2S protects against pressure overload-induced heart failure via upregulation of endothelial nitric oxide synthase[J]. Circulation, 2013, 127(10): 1116-1127.

Effect of hydrogen-rich saline on cardiac remodeling after myocardial infarction

WANG Qiang,YNAG Yongjian,LI De,etal

(DepartmentofCardiology,ChengduMilitaryGeneralHospital,Chengdu610083,China)

Objective To investigate the effect of hydrogen-rich saline (HRS) on cardiac remodeling after myocardial infarction and explore the underlying mechanisms. Methods Male C57/BL6 mice were randomly divided into control group, myocardial infarction(MI) group and MI plus HRS group (n = 20). After the intervention for 21 days, the haemodynamic data and cardiac function were measured by echocardiography and a physiological recorder. The infarct area, cardiac hypertrophy and myocardial interstitial fibrosis were evaluated by HE and Masson staining. In addition, the oxidative stress and inflammation in the peri-infarct region were also determined. Results Treatment of HRS via intraperitoneal injection improved cardiac diastolic function (P<0.01,P<0.05), reduced infarct area size (P<0.01), inhibited cardiac hypertrophy and myocardial interstitial fibrosis after myocardial infarction.The treatment of HRS increased superoxide dismutase (SOD) activity, decreased malondialdehyde (MDA), tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin 1β (IL-1β), interleukin 6 (IL-6) and monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1) content in the peri-infarct region. Conclusion HRS may prevent cardiac remodeling and improve cardiac function via attenuating oxidative stress and inflammation.

Myocardial infarction； Cardiac remodeling； Hydrogen； Oxidative stress； Inflammation

國家自然科學基金(81170081、81500224)，全軍醫學科技青年培育項目(13QNP058)，四川省科技廳科技創新苗子工程培育項目(2015016)

楊永健，教授，博士生導師，本刊常務編委，E-mail：yangyongjian38@sina.com；李德，主任醫師，E-mail：lide660809@qq.com

R 542.2+2

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.03.004

2015-12-01； 修回日期： 2015-12-17； 編輯： 母存培)