施用有機肥對成熟期烤煙碳氮代謝關鍵基因表達的影響

連文力，楊勝男，賈宏昉，崔 紅

(河南農業大學 煙草學院，河南 鄭州 450002)

施用有機肥對成熟期烤煙碳氮代謝關鍵基因表達的影響

連文力，楊勝男，賈宏昉，崔 紅*

(河南農業大學 煙草學院，河南 鄭州 450002)

為了探明有機肥用量對烤煙碳氮代謝途徑關鍵基因表達的影響，設置3種有機肥施用量(0、200、600 kg/667 m2)來分析烤煙成熟期葉片碳氮代謝相關關鍵基因的表達水平。結果表明：施用有機肥顯著降低了碳代謝途徑中蔗糖合成酶基因(SUS)、蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)、顆粒結合型淀粉合成酶基因(GBSSI)和淀粉分支酶基因(SBE)的表達水平，3個處理表現為：CK>C200>C600。通過對氮代謝途徑關鍵基因硝酸還原酶(NITR)、亞硝酸還原酶(NIR)、谷氨酸脫氫酶(GDH)和谷氨酰胺合成酶(GS)中一個重要家族成員(GLN1-3)的表達分析表明：施用適量(200 kg/667 m2)有機肥對氮代謝途徑關鍵基因的表達量影響不顯著，僅在高用量(600 kg/667 m2)有機肥條件下表現出抑制。因此，通過添加不同有機肥用量對烤煙碳氮代謝關鍵基因的表達分析可以看出，有機肥處理下的碳氮代謝基因表達量明顯受到抑制，且與有機肥的施用量呈正相關性，有機肥對碳代謝途徑的影響大于氮代謝。

有機肥；碳代謝；氮代謝；基因表達；烤煙

煙草是我國重要的經濟作物，因此對其品質要求較為嚴格。在栽培生產中，常常為了片面地追求經濟效益而忽略了其品質，過量地施用化肥而忽略有機肥的使用，造成植煙土壤酸化、板結，有機質含量低，土壤微生物數量有所降低，引起了烤煙煙葉營養養分比例不協調，油分相對少，香氣量不足，進而限制了烤煙煙葉產量和品質的提高[1-3]。針對這種情況可以通過增施有機肥來代替化肥的施用。本試驗混合使用生物炭與草炭，可以明顯提高土壤肥力，減少養分損失，穩定肥效，從而改善土壤理化性狀，提高煙葉的品質[4-9]。

碳氮代謝是烤煙最基本的代謝過程，碳氮代謝活動的強弱、協調程度及其變化規律直接或間接地影響煙葉的物質成分，對煙葉的品質影響較大。有機肥的種類很多，包括生物炭、草炭等。關于有機肥在煙草上施用已有大量報道：王樹會等的研究結果表明增施草炭可以在一定程度上促進煙株生長，提高煙葉產量，降低煙葉淀粉含量，改善煙葉品質[10]，且與草炭用量呈負相關；王林虹等研究表明生物炭可以改善煙葉品質[11]。與作物碳氮代謝途徑相關的關鍵基因有蔗糖合成酶基因(SUS)、蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)、顆粒結合型淀粉合成酶基因(GBSSI)、淀粉分支酶(SBE)、硝酸還原酶(NITR)、亞硝酸還原酶(NIR)、谷氨酸脫氫酶(GDH)和谷氨酰胺合成酶(GS)中一個重要家族成員(GLN1-3)。目前，大多數研究的關注點是通過施用有機肥來促進土壤微生物新陳代謝，活化土壤養分，改善土壤結構，提高土壤肥力，改善作物品質；而如何從分子水平研究施用有機肥對作物碳氮代謝途徑的影響還未見報道。因此，本文通過草炭和生物炭混合組成的有機肥來研究對烤煙碳氮代謝的影響，從碳氮代謝關鍵基因表達水平上進行研究，從分子手段入手，以期為以后研究施用有機肥對烤煙品質的影響提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試烤煙品種為云煙87。

1.2 試驗設計

試驗于河南南陽金葉園——濃香型特色優質煙葉開發項目產區進行。試驗田土壤為黃壤土，肥力均勻適中，pH值為7.42，土壤有機質含量11.42 g/kg，堿解氮含量57.40 mg/kg，速效磷含量20.12 mg/kg，速效鉀含量121.18 mg/kg。供試有機肥由草炭和生物炭組成，其中生物炭占30%，草炭占70%。試驗設置3個處理，對照CK依照當地優質煙葉生產進行管理；處理1在對照的基礎上施用有機肥200 kg/667 m2(C200)；處理2在對照的基礎上施用有機肥600 kg/667 m2(C600)。各處理面積200 m2，重復3次。各項管理措施與當地最優措施保持一致。

1.3 樣品采集

采集中部葉(10～12葉位)，打頂日期為移栽后62 d，在移栽后62 d第1次取樣，以后每隔8 d取1次樣，整個成熟期共取5次樣。選擇5株長勢一致的煙株，混合取樣5 g。每個時期3個重復，迅速置于液氮中，于-80 ℃冰箱凍存，用于基因表達研究和代謝組學分析。

1.4 碳氮代謝基因的RT-PCR檢測

選取生長發育良好的中部葉，將來源于不同煙株的5片葉樣品混合以減少試驗誤差，并迅速置于液氮中冷凍保存。采用Trizol法提取煙草總RNA，樣品通過隨機引物法反轉錄合成cDNA。根據Genbank發布的蔗糖合成酶(SUS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)、顆粒型淀粉合成酶(GBSSI)、淀粉分支酶(SBE)、硝酸還原酶(NITR)、亞硝酸還原酶(NIR)、谷氨酸脫氫酶(GDH)、谷氨酰胺合成酶家族成員(GLN1-3)和內參基因L25的序列設計擴增引物，進行RT-PCR(表1)。

表1 擴增引物序列

1.5 數據處理

采用Image J軟件對RT-PCR檢測所得半定量圖片進行量化，提取各個基因表達的亮度相對值進行對比，每個基因均以內參L25為基準，再使用Excel 2013進行作圖分析。

2 結果與分析

2.1 不同有機肥處理對碳代謝關鍵基因表達的影響

由圖1和圖2可以看出，SUS基因在不同有機肥處理下的表達量不同，隨著生育期的推進CK處理下的基因表達量呈遞減的趨勢，C200和C600處理下的基因表達量則呈現遞增的趨勢。對照CK和C600處理下的表達量要強于C200處理下的。SPS基因在移栽后68 d C600處理下的表達量隨著生育期的推進有逐漸增強的趨勢，但SPS基因在CK和C200處理下的表達量要強于C600處理下的。顆粒結合型淀粉合成酶(GBSSI)是與直鏈淀粉合成直接有關的酶，它位于淀粉粒內部，使合成的直鏈淀粉保持未分支狀態[12]。GBSSI基因的表達量在移栽后68 d CK和C600處理下先下降再升高，但CK和C200處理下的表達量相對值明顯高于C600處理下的。淀粉分支酶(starch branching enzyme，SBE)是淀粉合成的限速酶，它能切開α-1，4-糖苷鍵連的寡糖片段，又能把切下的短鏈通過α-1，6-糖苷鍵連接于受體鏈上，形成分支結構。SBE基因在移栽后76 d CK下的基因表達量有增強的趨勢，而C200處理下的基因表達量則表現為先降低再升高，CK和C200處理下的基因表達量明顯強于C600下的。由以上的分析結果表明，施用有機肥處理對烤煙碳代謝的基因表達的影響為：CK>C200>C600。

2.2 不同有機肥處理對氮代謝關鍵基因表達的影響

如圖3、圖4所示，NITR基因在CK和C200處理下的表達量隨著生育期的推進有遞增的趨勢，C600處理下的變化規律不明顯；在同一時期不同處理下的NITR基因表達量相比，均是CK和C200處理要強于C600處理。NIR基因在CK和C200處理下的表達量隨著生育期的推進有逐漸增加的趨勢，而C600處理下的基因表達量則剛好相反，呈遞降的趨勢，除移栽后60 d外，NIR基因表達量在同一時期不同處理下，均是CK>C200>C600。谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase，GDH)在植物體內的作用主要是催化ɑ-酮戊二酸的氨化和谷氨酸的脫氨這一可逆反應。GDH在NH4+的合成及谷氨酸的代謝中具有十分獨特的作用，它在NH4+的合成和再合成中起初始性作用，并在谷氨酸合成循環中起補充作用。GDH基因在CK處理下的基因表達量隨著生育期的推進呈逐漸增強的趨勢，而在C200處理下的基因表達量在移栽后84 d達到最大值后又開始下降；相反，GDH基因在C600處理下的表達量則是隨著生育期的推進呈遞降的趨勢。移栽后60 d和68 d的GDH基因表達量表現為C600略高于CK和C200，其它均表現為CK>C200>C600。GLN1-3為谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)家族的重要成員，谷氨酰胺合成酶(GS)是處于氮代謝中心的多功能酶，參與多種氮代謝的調節[13]，GS常與谷氨酸合酶(glutamate synmase，GOGAT)協同作用，組成GS/GOGAT循環，該循環承擔著氮代謝的中心作用。GLN1-3基因在CK處理下的表達量隨著生育期的推進有逐漸增強的趨勢，在C200處理下的表達量自移栽后68 d開始亦是逐漸增加，相反，C600處理下的基因表達量隨著生育期的推進有逐漸降低的趨勢。以上的分析結果表明，氮代謝的關鍵基因表達量表現為CK>C200>C600。

圖1 不同有機肥處理下碳代謝關鍵基因表達檢測

圖2 不同有機肥處理下碳代謝關鍵基因的表達量

圖3 不同有機肥處理下氮代謝關鍵基因表達檢測

3 結論與討論

在煙葉生長發育過程中，煙葉碳氮代謝平衡影響煙葉的最終品質[14]。施用有機肥顯著降低了碳代謝途徑中蔗糖合成酶基因(SUS)、蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)、顆粒結合型淀粉合成酶基因(GBSSI)和淀粉分支酶基因(SBE)的表達水平，3個處理表現為：CK>C200>C600。對氮代謝途徑中關鍵基因硝酸還原酶(NITR)、亞硝酸還原酶(NIR)、谷氨酸脫氫酶(GDH)和谷氨酰胺合成酶(GS)中一個重要家族成員(GLN1-3)的表達分析表明施用適量(200 kg/667 m2)有機肥對氮代謝途徑關鍵基因的表達量影響不顯著，僅在高用量(600 kg/667 m2)有機肥條件下表現出抑制。因此，從分子水平通過添加不同有機肥用量對烤煙碳氮代謝的研究結果可以看出，有機肥處理下的碳氮代謝基因表達量明顯受到抑制，且與有機肥的施用量呈正相關；有機肥對碳代謝途徑的影響大于氮代謝。

圖4 不同有機肥處理下氮代謝關鍵基因的表達量

淀粉和全氮是衡量煙葉品質的重要指標，與碳氮代謝途徑密切相關。大量研究表明碳氮代謝與有機肥的施用密切相關。王樹會等研究表明增施草炭可以有效降低煙葉的淀粉含量[7]。本研究從分子水平研究碳代謝途徑關鍵基因與有機肥施用量的關系。發現成熟期隨著有機肥施用量的增加，從碳代謝途徑基因表達上來看，基因表達顯著降低，與前人報道的淀粉含量降低相一致。生物炭有很強的吸附性能，被認為可以吸附和保持土壤礦質營養元素，有效減少雨水沖刷造成的氮、磷流失，從而相應提高留存于土壤中的養分。Lehmann等指出當生物炭和肥料配施后，生物炭可以通過吸附NO3-、NH4+，減少土壤的氨揮發與土壤氮素流失，來提高氮肥利用率[15]。曲晶晶等得出相似結論，認為施用生物炭提高水稻的氮肥吸收利用率達20.33%[16]。王麗淵在對煙草的研究中發現，在正常供氮條件下，中部葉總氮含量隨生物炭的施用量增加而顯著提高[17]。本研究發現成熟期隨著有機肥施用的增加，從氮代謝途徑基因表達上來看，該途徑關鍵基因表達也有降低趨勢，尤其是在C600處理下，基因表達顯著降低。前人研究表明使用有機肥可以提高總氮含量，這可能與生物炭可以提高土壤的養分含量密切相關，雖然氮代謝降低，但是土壤中的氮素利用率提高了，所以導致最終葉片全氮含量隨著生物炭用量的增加而提高。

綜上所述，施用不同用量的有機肥對烤煙碳氮代謝的影響較為明顯，增施有機肥后碳氮代謝減弱，尤其是C600處理影響較大，表達量明顯低于CK和C200處理。

[1] 肖漢乾,李德清,徐雙紅,等.不同生物活性肥對烤煙生長影響的初步研究[J].中國煙草科學,2003,24(1):28-30.

[2] 李洪勛.有機肥與烤煙生產關系的研究進展 [J].中國土壤與肥料,2007(1):5-12.

[3] 陳雪,喻奇偉,符云鵬.不同土壤改良措施對烤煙產質量的影響[J].江西農業學報,2015,27(2):67-70.

[4] Rebecca R. Rethinking biochar[J]. Environmental Science & Technology, 2007, 41(17): 5932-5933.

[5] Yu X Y, Ying G Q, Kookana R S. Reduced plant uptake of pesticides with biochar additions to soil[J]. Chcmosphere, 2009, 76(5): 665-671.

[6] Kim I, Yu Z Q, Xia B H, et al. Sorption of male hormones by soils and sediments[J]． Environmental Toxicology and Chemistry, 2007, 26: 264-270.

[7] 王忠強,劉婷婷,王升忠,等.泥炭在環境修復中的應用研究概況和展望[J].科技通報,2007,23(2):277-281.

[8] 閻小毛,閆伸,李彥平,等.不同施肥模式對豫中植煙土壤理化性狀及土壤微生物數量的影響[J].江西農業學報，2015,27(3):45-49.

[9] 尹冬,張勇江,張友武,等.不同施氮量對烤煙K326 生長發育及產質量形成的影響[J].江西農業學報,2015，27(6):106 -109.

[10] 王樹會,高家合.不同草炭處理對植煙土壤理化性狀及煙葉產質影響研究[J].中國農學通報,2006,22(12):377-379.

[11] 王林虹,劉國順,何永秋,等.不同肥料配比對烤煙化學品質和香氣物質的影響[J].江蘇農業科學，2014,42(6):92-95.

[12] Smith A M, Denyer K, Martin C. The synthesis of the starch granule[J]. Annu Rev Plant Mol Biol， 1997, 48(1): 67-87.

[13] 王月福,于振文,李尚霞,等.氮素營養水平對冬小麥氮代謝關鍵酶活性變化和籽粒蛋白質含量的影響 [J].作物學報,2002,28(6):743-748.

[14] 黃樹永,陳良存.煙草碳氮代謝研究進展[J].河南農業科學,2005(4):8-11.

[15] Lehmann J, Rillig M C, Thies J, et al. Biochar effects on soil biota： A review [J]. Soil Biology & Biochemistry， 2011, 43(9)： 1812-1836.

[16] 曲晶晶,鄭金偉,鄭聚峰,等.小麥秸稈生物質炭對水稻產量及晚稻氮素利用率的影響[J].生態與農業環境學報，2012,28(3):288-293.

[17] 王麗淵.生物炭對植煙土壤主要性狀及烤煙生長的影響[D].鄭州:河南農業大學，2014.

Effect of Organic Fertilizer Application on Expression of Key Genes Related to Carbon and Nitrogen Metabolism in Flue-cured Tobacco at Maturity Stage

LIAN Wen-li, YANG Sheng-nan, JIA Hong-fang, CUI Hong*

(College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

In order to determine the effects of organic fertilizer application on carbon and nitrogen metabolism key genes expressions of flue-cured tobacco, different organic fertilizer applications(0, 200, 600 kg/667 m2) were set in this study, which analyzed carbon and nitrogen metabolism related genes expressions of flue-cured tobacco in maturity. The results showed that sucrose synthase (SUS), sucrose phosphate synthase (SPS), granule-bound starch synthase (GBSSI) and starch branching enzyme (SBE) were decreased conspicuously by applying organic fertilizer and three treatments were as follows: CK>C200>C600. The expressions of nitrogen metabolism related genes nitrate reductase (NITR), nitrite reductase(NIR), glutamate dehydrogenase(GDH) and an important family members(GLN1-3) of glutamine synthesis enzymes(GS) were elucidated that nitrogen metabolism related genes expressions were not significant in applying appropriate organic fertilizer (200 kg/667 m2) and inhibited in higher organic fertilizer (600 kg/667 m2). Therefore, which could be found that expressions of carbon and nitrogen related gene of flue-cured tobacco were inhibited significantly and positive correlation with organic fertilizer application by applying different organic fertilizer, the effect of organic fertilizer on carbon metabolism was more than that of nitrogen metabolism.

Organic fertilizer; Carbon metabolism; Nitrogen metabolism; Gene expression

2015-11-04

中國煙草總公司特色優質煙葉開發重大專項(110200902045 TS-01)。

連文力(1991─)，男，碩士研究生，研究方向為煙草生物技術。*通訊作者：崔紅。

S572

A

1001-8581(2016)03-0020-04

許晶晶)