不同施肥水平對黑莓生長發(fā)育的影響

楊海燕，吳文龍，李維林，閭連飛，衛(wèi)云麗，董珊珊

(江蘇省中國科學(xué)院植物研究所，江蘇 南京 20014)

不同施肥水平對黑莓生長發(fā)育的影響

楊海燕，吳文龍，李維林*，閭連飛，衛(wèi)云麗，董珊珊

(江蘇省中國科學(xué)院植物研究所，江蘇 南京 20014)

以生產(chǎn)上表現(xiàn)優(yōu)異的赫爾(Hull)和卡伊娃(Kiowa)黑莓品種為試驗(yàn)材料，在大田栽培條件下進(jìn)行不同施肥水平的處理，3次施肥結(jié)束后進(jìn)行相關(guān)生理指標(biāo)的測定。結(jié)果表明：隨著施肥量的增加，Hull品種葉片葉綠素含量、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性先升后降，在L2施肥水平達(dá)到峰值，超氧陰離子自由基(O2-·)產(chǎn)生速率、過氧化氫(H2O2)和丙二醛(MDA)含量隨著施肥量的增加均有所下降，可溶性蛋白含量在各施肥水平下變化不明顯；Kiowa品種葉綠素含量在L2施肥水平有所增加，在其他施肥水平變化不明顯，O2-·、H2O2和可溶性蛋白含量變化不明顯，MDA含量和SOD活性有所下降，POD活性隨著施肥量增加先升后降，在L2施肥水平達(dá)到峰值。結(jié)論認(rèn)為，Hull較Kiowa肥效顯著，但2個(gè)品種均在L2施肥水平表現(xiàn)出較旺盛的生理活動(dòng)，2個(gè)品種的最佳施肥水平是L2水平，即每株每次追肥的用量為60 g尿素和60 g磷酸二氫鉀。

黑莓；施肥；抗氧化系統(tǒng)；生長發(fā)育

黑莓(Rubusspp.)是第3代小果類果樹的重要成員，在北美已有100多年的栽培歷史，其果實(shí)柔嫩多汁，酸甜爽口，營養(yǎng)豐富，適宜加工成酒類、飲料及其他各種食品，深受國內(nèi)外消費(fèi)者的青睞[1-2]。黑莓適應(yīng)性強(qiáng)，生長快，結(jié)果早，產(chǎn)量高，由江蘇省中國科學(xué)院植物研究所于1986年引種[2]，已選育出數(shù)個(gè)優(yōu)良品種在中國南方丘陵山地推廣種植，栽培面積目前已達(dá)到4000 hm2以上[3]。合理施肥是獲得果樹高產(chǎn)的有效措施，不同的施肥水平對黑莓的營養(yǎng)生長有很大影響。本研究對不同黑莓品種在不同施肥水平下的生理效應(yīng)進(jìn)行了比較分析，以期為江蘇地區(qū)黑莓栽培管理中肥料的合理利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

赫爾(Hull)和卡伊娃(Kiowa)品種黑莓種植于江蘇省中國科學(xué)院植物研究所溧水試驗(yàn)基地，為兩年生結(jié)果樹。UV-754型分光光度計(jì)。所有試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 施肥方法 本試驗(yàn)是在基肥使用基礎(chǔ)上開展的追肥試驗(yàn)。在早春黑莓種植園統(tǒng)一施用有機(jī)復(fù)合肥[(有機(jī)質(zhì)含量≥45%，(N+P2O5+K2O)≥5%)]500 g，無機(jī)復(fù)合肥(N 15%、P 15%、K 15%)100 g，距離植株40～50 cm開溝深20～30 cm施入。追肥在黑莓生長季節(jié)開花結(jié)果的關(guān)鍵時(shí)期分3次進(jìn)行，時(shí)間為3月15日、4月15日和5月15日。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理，施肥水平分別為L1：30 g尿素+30 g磷酸二氫鉀；L2：60 g尿素+60 g磷酸二氫鉀；L3：90 g尿素+90 g磷酸二氫鉀；以不施肥為對照(CK)。每處理設(shè)5株定點(diǎn)觀測，取均值。試驗(yàn)地條件相同，各試驗(yàn)樹管理水平一致。3次施肥結(jié)束15 d后，取葉片進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定。

1.2.2 葉綠素含量的測定 稱取0.2 g葉片，用80%丙酮研磨成勻漿，4 ℃下8000 r/min離心10 r/min，用丙酮定容至8 mL，分別測定470、663和645 nm處的吸光值，根據(jù)公式計(jì)算葉綠素含量[4]。

1.2.3 超氧陰離子自由基(O2-·)產(chǎn)生速率的測定 取0.5 mL樣品粗酶液，加入1 mL 1 mmol/L鹽酸羥胺和0.5 mL 50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.8)，混勻，25 ℃下保溫1 h，然后再加入1 mL 7 mmol/L α-萘胺和1 mL 17 mmol/L對氨基苯磺酸，搖勻，25 ℃下保溫20 min，測定530 nm處的吸光值，根據(jù)公式計(jì)算O2-·的產(chǎn)生速率[5]。

1.2.4 丙二醛(MDA)含量的測定 取1.0 g葉片，用10%三氯乙酸溶液研磨，4 ℃下4000 r/min離心10 min，定容至6 mL，取2 mL上清液，加入0.6%硫代巴比妥酸(TBA)溶液2 mL，混勻后沸水浴反應(yīng)15 min，迅速冷卻并離心，取其上清液，分別測定532、600和450 nm處的吸光值，根據(jù)公式計(jì)算MDA含量[6]。

1.2.5 過氧化氫(H2O2)含量的測定 過氧化氫(H2O2)含量采用從南京建成生物工程研究所購買的H2O2試劑盒進(jìn)行測定，采用一般分光光度法。

1.2.6 可溶性蛋白含量的測定 取2 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，加入0.5 mL樣品粗酶液，混勻，反應(yīng)10 min后測定595 nm處的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)含量[7]。

1.2.7 超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定 SOD活性的測定采用黃嘌呤氧化酶法[8]，稱取1.0 g葉片，用50 mmol/L的磷酸緩沖液(pH 7.8)研磨，4 ℃下10000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行酶活性分析，以每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對應(yīng)的SOD量作為1個(gè)酶活力單位。

1.2.8 過氧化物酶(POD)活性的測定 POD活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法[9]，吸取1 mL樣品粗酶液，加入3 mL反應(yīng)液，混勻后在470 nm處測定其吸光值，每隔30 s讀數(shù)1次，以每分鐘吸光度的變化0.01作為1個(gè)酶活力單位。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)分析 用Excel 2003分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總、統(tǒng)計(jì)與分析，用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥水平對黑莓葉片葉綠素含量的影響

葉綠素含量的高低直接反映植物光合能力的強(qiáng)弱。從表1可以看出，隨著施肥量的增加，Hull品種總的葉綠素含量是逐漸上升的，均顯著高于對照，雖然在L3處理水平上有所下降但仍比對照增加28.05%，葉綠素a(Chla)和葉綠素b(Chlb)的變化趨勢與總量的變化趨勢一致；Kiowa品種的總?cè)~綠素含量變化趨勢不大，L2處理水平與對照相比增加了10.02%，其他水平無顯著差異，Chla和Chlb的變化趨勢與總量的變化趨勢一致。

表1 不同施肥水平對黑莓葉綠素含量的影響

注：同列字母相同表示差異不顯著，不同則表示差異顯著。下同。

2.2 不同施肥水平對黑莓葉片O2-·產(chǎn)生速率和H2O2含量的影響

O2-·和H2O2是代謝過程中產(chǎn)生的主要活性氧自由基，對膜脂具有較強(qiáng)的氧化作用。從圖1可以看出，O2-·產(chǎn)生速率和H2O2含量隨著施肥量的增加均有所下降，其中Hull與Kiowa相比下降較為明顯，O2-·產(chǎn)生速率和H2O2含量在L3處理水平分別降為對照的77.02%和59.45%，表明隨著施肥量的增加，植株生長旺盛、抗性增強(qiáng)。

2.3 不同施肥水平對黑莓葉片MDA含量的影響

MDA是植物膜脂過氧化產(chǎn)物。從圖2可以看出，MDA含量隨著施肥量的增加均有所下降，其中Hull與Kiowa相比下降較為明顯，MDA含量在L3施肥水平降為對照的71.05%，表明合理施肥能夠使植株生長旺盛，并延緩衰老。

圖1 不同施肥水平對黑莓葉片O2-·產(chǎn)生速率和H2O2含量的影響

圖2 不同施肥水平對黑莓葉片MDA含量的影響

2.4 不同施肥水平對黑莓葉片可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白含量的高低直接反映了黑莓植株體內(nèi)生理活動(dòng)的旺盛程度。從圖3可以看出，在L1和L2處理水平下Hull品種的可溶性蛋白含量與對照相比無顯著變化，在L3處理水平下略有所下降，比對照下降了8.71%；Kiowa品種的可溶性蛋白含量在各處理水平下與對照相比均無顯著變化。

2.5 不同施肥水平對黑莓葉片SOD和POD活性的影響

SOD將O2-·快速歧化為H2O2和O2，POD主要負(fù)責(zé)清除細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜的H2O2。從圖4可以看出，隨著施肥水平的增加，Hull葉片的SOD和POD活性呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在L2處理水平下達(dá)到峰值，分別為對照的115.78%和154.55%；Kiowa品種的SOD活性與對照相比均有所下降，POD活性呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在L2處理水平下達(dá)到峰值，為對照的188.89%。

圖3 不同施肥水平對黑莓葉片可溶性蛋白含量的影響

圖4 不同施肥水平對黑莓葉片SOD和POD活性的影響

3 結(jié)論與討論

氮素是葉綠素的主要組成成分，不斷增加的氮素含量具有促進(jìn)植物葉片葉綠素合成的作用[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著施肥量的提高，Hull品種的葉綠素含量呈現(xiàn)上升的趨勢，但是L3處理水平下葉綠素含量低于L2處理水平，葉片葉綠素含量的下降可能是由于過多的氮素加快了新葉的萌發(fā)速率，導(dǎo)致葉片柵欄組織發(fā)育不良，成熟葉片生長因此受到了一定的限制[10]。Kiowa品種葉綠素含量在不同施肥水平下變化不是很明顯，但在L2處理水平下，葉綠素含量有所升高，單從葉綠素水平來講，L2處理水平是較適宜的施肥量。

O2-·和H2O2是植物光合、呼吸等代謝過程中產(chǎn)生的主要的活性氧自由基，大量積累會(huì)引發(fā)膜脂的過氧化[11]。試驗(yàn)結(jié)果表明，O2-·產(chǎn)生速率和H2O2含量隨著施肥量的增加均有所下降，肥料的使用使得黑莓啟動(dòng)了其自身的抗逆防御系統(tǒng)，但品種間存在差異。Hull品種在L3處理水平下，O2-·產(chǎn)生速率和H2O2含量達(dá)到最低水平，而Kiowa品種在該處理水平下O2-·的生產(chǎn)速率無顯著變化。作為是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，MDA在植物體內(nèi)的含量間接反映了細(xì)胞受損傷的程度[12]。Hull與Kiowa相比MDA含量下降較為明顯，這可能與Hull品種葉片SOD和POD酶活性的上升有關(guān)。SOD和POD是抗氧化系統(tǒng)中重要的保護(hù)酶類，SOD主要催化O2-·發(fā)生歧化反應(yīng)，生成氧化性較弱的H2O2，H2O2在POD作用下被還原為H2O[11]，從而抑制了O2-·和H2O2的積累，降低了其對植株的毒害作用。這同時(shí)也表明合理施肥在一定程度上可以提高黑莓植株葉片酶活性，增強(qiáng)黑莓的抗逆性。此外，對玉米的施肥研究表明[13]，合理施肥能夠提高葉片的SOD活性；對大豆的施肥研究也表明[14]，在一定程度上增加施肥量，其SOD和POD活性均有所增加，有利于提高大豆抵抗逆境的能力。

綜上所述，提高施肥量能夠促進(jìn)黑莓的生長發(fā)育，提高黑莓的葉綠素含量和抗氧化酶活性，降低自由基水平，但是黑莓對肥料的需求有一定的限量，過多施肥會(huì)對植株的生長產(chǎn)生負(fù)面影響，因此對黑莓的肥料的使用一定要適量。在本研究中，黑莓2個(gè)品種的最佳施肥水平是L2水平，即每株每次追肥的用量為60 g尿素和60 g磷酸二氫鉀。但是需要指出的是，本研究僅為一年的試驗(yàn)結(jié)果，且對前期基肥的施用對后期肥料施用的影響未考慮，因此所得出的結(jié)論還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

[1] Bernadine C S, John R C, Chad E F, et al. Worldwild blackberry production[J]. Hort Technology, 2007, 17(2): 205-213.

[2] 吳文龍,陳岳,閭連飛,等.黑莓、樹莓在南京地區(qū)的引種研究[J].江蘇林業(yè)科技,2006,33(2):13-15.

[3] 李維林,孫醉君,吳文龍.江蘇省黑莓區(qū)域性栽培試驗(yàn)[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào),2003,12(1):38-42.

[4] Arnon D I. Copper enzymes in isolated chloroplasts polyphenol oxidase in beta vulgaris[J]. Plant Physiology, 1949, 24: 1-5.

[5] 羅廣華,王愛國.植物的超氧物自由基與羥胺反應(yīng)的定量關(guān)系[J].植物生理學(xué)通訊,1990(6):94-95.

[6] Heath R L, Parker L. Photoperoxidation in isolated chloroplasts：Ⅰ. Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1968, 125(1): 189-193.

[7] Bradford M A. Rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding[J]. Analytical Biochemistry, 1976, 72(5): 248-254.

[8] Beyer W F, Fridsovich I. Assaying for superoxide dismutase activity: Some large consequences of changes in conditions[J]. Analytical Biochemisty, 1987, 161(2): 559-566.

[9] Maehly A C. Plant peroxidase[J]. Methods in Enzymology, 1955(2): 801-813.

[10] 王履清,張邊江,唐寧.氮素匱乏對小麥光合特性的影響[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,53(8):1758-1761.

[11] Anjum S A, Farooq M, Xie X Y, et al. Antioxidant defense system and proline accumulation enables hot pepper to perform better under drought[J]. Science Horticultural, 2012, 140: 66-73.

[12] 段如雁,韋小麗,孟憲帥.不同光照條件下花櫚木幼苗的生理生化響應(yīng)及生長效應(yīng)[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2013,33(5):30-34.

[13] 周曉琳,薛登峰,劉樹堂,等.長期定位施肥對夏玉米酶活性的影響[J].玉米科學(xué),2009,17(3):116-119.

[14] 齊玉鑫,李文濱,任海祥,等.施肥量和種植密度對大豆牡豐7號(hào)保護(hù)性酶活性的影響[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),2012(5):47-49.

Effect of Different Fertilizer Application Rates on Growth and Development of Blackberry

YANG Hai-yan, WU Wen-long, LI Wei-lin*, LV Lian-fei, WEI Yun-li, DONG Shan-shan

(Institute of Botany, Jiangsu Provincial and Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210014, China)

Taking blackberry cultivars ‘Hull’ and ‘Kiowa’ as experimental material, proceeding different fertilizer treatments test in field cultivation, measuring the related physiological indicators after 3 fertilizations. The results showed that concentrations of photosynthetic pigments and activities of superoxide dismutase (SOD) and peroxidase (POD) in ‘Hull’ increased first and then decreased, and reached the peak value in L2treatment, The contents of hydrogen peroxide (H2O2) and malondialdehyde (MDA) and the generation rate of O2-· decreased progressively, while no significant change was observed in soluble proteins. There were also no significant changes in O2-·, H2O2and soluble proteins in the leaves of ‘Kiowa’, the content of Chlorophyll pigments in ‘Kiowa’changed slightly as the concentration increased, except for a few increase at the concentration of L2treatment. MDA content and SOD activity slightly declined under the different fertilization treatments, POD activity increased as the fertilization content increasing, reaching the peak value in L2treatment. The results indicated that the fertilizer efficiency of ‘Hull’ was more significant than that of ‘Kiowa’, but both ‘Hull’ and ‘Kiowa’ showed a strong physiological activity in L2treatment, and the optimum fertilizer applying level was in L2treatment, the amount of fertilizer were 60 g urea and 60 g potassium dihydrogen phosphate per plant.

Blackberry (Rubusspp.); Fertilization; Antioxidant system; Growth and development

2015-08-13

江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(BE2013440，BE2013309)；江蘇省農(nóng)業(yè)三新工程項(xiàng)目(SXGC[2013]347)；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目(CX(14)2021)。

楊海燕(1983─)，女，江蘇常州人，助理研究員，研究方向：黑莓等小果類生物技術(shù)研究。*通訊作者：李維林。

S663.2

A

1001-8581(2016)03-0007-04

許晶晶)