添加生物炭對烤煙碳氮代謝的影響

張嘉煒,楊永霞,馮小虎,賈宏昉,張松濤,張洪映,崔 紅*

(1.河南農業大學 煙草學院，河南 鄭州 450002；2.江西省煙草公司 撫州市公司,江西 撫州 344000)

添加生物炭對烤煙碳氮代謝的影響

張嘉煒1,楊永霞1,馮小虎2,賈宏昉1,張松濤1,張洪映1,崔 紅1*

(1.河南農業大學 煙草學院，河南 鄭州 450002；2.江西省煙草公司 撫州市公司,江西 撫州 344000)

為探究添加生物炭對烤煙碳氮代謝的影響，以煙草品種K326為材料，從細胞組織結構、基因表達以及物質代謝3個層面進行了系統研究。超微結構分析表明：中部葉成熟早期，不施生物炭處理的煙葉淀粉粒積累較多，隨著葉片成熟降解更快。基因表達分析顯示：打頂后，糖、淀粉代謝相關基因表達逐漸增強，氮代謝相關基因的表達減弱。中部葉成熟后期，添加生物炭越多，相關基因表達越強。物質代謝分析表明：打頂后，添加生物炭處理的總糖、還原糖含量降低，調制后，糖含量較高。打頂及調制后，添加600 kg/hm2生物炭處理的淀粉含量較高。添加生物炭后，總氮、煙堿含量增加，調制后差異變小，這說明添加生物炭對煙葉碳氮代謝有較大影響，進而影響煙葉品質。

烤煙；碳氮代謝；生物炭；基因表達

在煙株生長發育過程中,碳氮代謝是最基本的代謝過程,尤其是在成熟過程中,煙葉各種化學成分的組成、比例及含量受碳氮代謝的強度、動態變化模式和協調程度的影響很大[1]。淀粉、總糖和還原糖含量既是碳代謝的關鍵指標，又是重要的致香物前體物。氮素調控煙葉內的能量代謝和物質轉化，同時也是烤煙生產的重要營養元素之一，對煙葉品質具有很大的影響[2-4]。因此，優質煙葉的生產必須調控碳氮代謝的平衡，控制碳氮代謝相關物質在適宜的范圍內。煙草碳氮代謝受多種因素影響，如品種、發育時期、栽培措施、肥料、生態環境、成熟度等都會影響碳氮代謝的強度[5-14]。

生物炭(Biochar)是以自然界廣泛存在的木材、家禽糞便和秸稈等生物質資源為基礎，在相對較低的溫度(<700 ℃)和無氧或限氧的條件下炭化熱解而得到的一種細粒、多孔的碳質材料[15]，具有良好的綜合生物效應[16]。研究表明，添加生物炭能夠提高根系生理活性、改良根系形態、增強土壤肥力、維持較為適宜的根冠比，從而提高作物產量[17-21]。此外，添加生物炭還能影響土壤微生物群落的組成、氮循環尤其是銷態氮的代謝、減輕重金屬積累[22-25]。目前，生物炭在煙草上的研究主要集中在對植煙土壤的理化性質及經濟性狀的影響上[26-27]。本試驗通過對植煙土壤添加不同量的生物炭，從細胞組織結構、分子機理以及物質代謝3個層面，系統地研究了生物炭對煙株生長發育及調制后碳氮代謝的影響，為優質煙葉生產提供了一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和設計

2013年在江西省撫州市廣昌縣長橋鎮種植煙草品種K326。按照當地優質煙栽培技術規范實施管理。行距1.3 m，株距50～55 cm，試驗地為水田砂壤土，土壤有機質為25.8 g/kg、堿解氮210 mg/kg、速效磷10 mg/kg、速效鉀76 mg/kg、pH值5.2。在初花期進行打頂，足量留葉。并對中部葉(第12葉位)進行掛牌標記。試驗添加的生物炭原材料為花生殼，加工時，首先將風干的花生殼粉碎，然后裝入炭化爐中，在500 ℃密封低氧狀態下連續炭化，而后過篩，制成直徑為3～5 mm的顆粒狀生物炭。

試驗田分為4個處理:常規施肥(CK)；T1：在常規施肥的基礎上，增施生物炭肥300 kg/hm2；T2：在常規施肥的基礎上，增施生物炭肥600 kg/hm2；T3：在常規施肥的基礎上，增施生物炭肥900 kg/hm2。

1.2 試驗方法

1.2.1 煙草葉片超微結構觀察 分別在打頂后10、20、30、40 d，按照文獻[5]的方法取樣。取中部葉第6～8條側脈間1 mm×3 mm的葉肉組織切片，于5%戊二醛溶液中4 ℃條件下固定保存。經固定、脫水、包埋、切片及雙重染色后，于Hitachi 600透射電鏡下觀察并拍照。

1.2.2 碳氮代謝關鍵基因表達分析 分別在打頂后10、20、30、40 d，取中部葉片，每個樣品取自3株不同煙株的中部葉去除主脈后混合，迅速用錫箔紙包裹放入液氮冷凍，帶回實驗室于-80 ℃冰箱中保存。煙葉總RNA的提取采用Trizol法，反轉錄采用隨機引物法。查詢Genbank發布的煙草碳氮代謝關鍵基因序列，采用Primer Premier 5軟件設計引物，以L25為參考序列，具體引物序列見表1，采用半定量RT-PCR進行基因表達差異研究。PCR反應體系為20 μL，PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，50 ℃(退火溫度根據基因不同而變化)復性30 s；72 ℃延伸1 min，共35個循環；最后72 ℃延伸10 min。采用1.0%瓊脂糖凝膠進行PCR產物的檢測。

表1 引物序列

1.2.3 化學成分分析 在煙草生長發育過程中的取樣時期同上，每個樣品取自3株不同煙株的中部葉，并混合，液氮保存，備用。烤后樣品由專職評級人員按照國標進行煙葉分級，采用定等級取樣法采集C3F(中橘三)。每個樣品取3 kg用于化學成分測定，煙樣烘干、粉碎后過60目篩備用。

采用德國Seal-AA3流動分析儀(德國BRAN & LU-EBBE公司生產)測定煙葉常規化學成分，樣品的前處理過程如下：于50 mL磨口三角瓶中，精確稱取0.25 g試樣，加入25 mL 5%醋酸溶液后在振蕩器上震蕩萃取30 min。用定性濾紙過濾后采用Seal-AA3連續流動分析儀按YC/T 159─2002、YC/T 216─2002標準分別測定煙葉煙堿、總糖、還原糖和淀粉含量。總氮的測定采用YC/T 161─2002標準進行。測定前，于0.1 g樣品中加入1 g K2SO4、0.1 g HgO和5 mL濃硫酸，消化3 h，用定性濾紙過濾后定容到100 mL即可進行總氮的測定。

2 結果與分析

2.1 葉綠體超微結構

圖1超微結構顯示，添加不同量生物炭處理的細胞組織結構變化規律趨于一致，中部葉成熟前期，煙葉淀粉粒積累相對較少、體積變化較小，且未添加生物炭處理的淀粉粒體積相對較小。隨著葉片成熟，淀粉顆粒逐漸積累，至打頂后40 d，不添加生物炭處理的淀粉積累較多。成熟后期，類囊體片層消失，嗜鋨顆粒增加，細胞表現出衰老降解的特點。不施生物炭處理(CK)的降解更充分、發育更快。

CK、T1、T2、T3的1～4分別表示CK、T1、T2、T3打頂后10、20、30、40 d(х10000)，ST:淀粉粒，DO：嗜鋨顆粒，Ch:葉綠體

2.2 碳氮代謝途徑關鍵基因表達規律

由圖2可知，打頂后10和40 d，與糖代謝過程中庫結構的膨大生長密切相關的液泡轉化酶(Vacuolar invertase,Vi)、與糖積累有關的磷酸合成酶(Sucrosephosphatesynthase,SPS)、蔗糖磷酸化酶(Sucrose-6-phosphate phosphatase,SPP，催化蔗糖和磷酸分解)和蔗糖合成酶(Sucrose synthase,SuS，降解蔗糖，提供合成淀粉等多糖的葡萄糖供體)，以及與淀粉代謝有關的基因ADPG焦磷酸化酶(ADP Glucose Pyrophosphorylase，AGPase)和顆粒結合型淀粉合成酶(Granule-bound starch synthase，GBSSI，控制直鏈淀粉的合成)均表現為CK和T3處理表達較強。打頂后20 d，T1處理的基因表達較強；打頂后30 d，T2處理的煙葉基因表達最強，這說明中部葉成熟后期，添加生物炭越多，糖、淀粉代謝相關基因表達越強。隨著葉片成熟氮代謝相關基因表達呈現逐漸減弱的趨勢。打頂后，與氮代謝有關的硝酸還原酶(Nitrate reductase,Nitr，主要作用是把NO3-離子還原成NO2-離子，是氮代謝的第一個關鍵酶和限速酶)總體表現為T2處理的基因表達較強，亞硝酸還原酶(Nitrite reductase,NIR，主要作用是把NO2-離子還原成NH4+離子)和催化產生谷氨酰胺合成的氨酰胺合成酶(Glutamine synthase，GS，N素轉移酶)則表現為T2和T3處理的表達較強。

圖2 不同處理的碳氮代謝相關基因表達差異比較

2.3 不同生物炭處理常規化學成分分析

由圖3可知，打頂后隨著煙株的生長，各處理的總糖和還原糖含量變化趨勢基本相同，均呈現出在打頂后含量下降，而在打頂后30 d開始上升。CK的總糖、還原糖含量高于施用生物炭的處理。T1與T3的含量變化趨勢相似，兩者的總糖含量在打頂后20 d略微下降，之后上升，打頂后40 d上升明顯。T2在打頂后30 d的含量最低，之后明顯上升。調制后，添加生物炭越多，總糖、還原糖含量也越高。

圖3 不同處理的糖含量變化趨勢

由圖4可知，打頂后，隨著煙株的生長，除T2外，其余各處理的淀粉含量變化趨勢基本相同，均呈現出淀粉含量逐漸增加的趨勢，打頂后40 d煙葉采收期達到最高。其中，CK的含量最高。而T2處理在打頂后40 d的淀粉含量有所降低。調制后，以T2處理的淀粉含量最高。

圖4 不同處理的淀粉含量變化趨勢

如圖5所示，打頂后，除T3外，其余各處理的煙堿含量大體呈上升趨勢。且CK的煙堿含量均低于其他處理。調制后，各處理的煙堿含量相差較小，而T3的煙堿含量略低于其余各處理。打頂后，總氮含量總體呈現逐漸降低的趨勢。在煙葉生長發育期間，總氮含量較低。調制后，各處理的差異不大。

圖5 不同處理的煙堿和總氮含量變化趨勢

3 小結與討論

碳氮代謝是煙草生長發育的基本過程，煙葉品質在很大程度上受煙株碳氮代謝的平衡和協調程度的影響。生物炭作為一種新型的材料，因其綜合生物效應良好，目前在生產上應用較廣。添加生物炭可以改善土壤理化性質、持留土壤養分、促進植物生長[16]。通過對細胞組織結構的分析表明：中部葉成熟早期，不施生物炭處理的煙葉淀粉粒積累較多，但淀粉粒較小。而對碳氮代謝相關基因的表達分析顯示：打頂后，糖、淀粉、代謝相關基因表達逐漸增強，氮代謝相關基因的表達逐漸減弱。添加300 kg/hm2和600 kg/hm2生物炭處理的相關基因表達整體較強。這說明添加生物炭后，糖、淀粉代謝相關基因表達更活躍。而對應的物質代謝分析表明，打頂及調制后，添加600 kg/hm2生物炭處理的淀粉含量較高。打頂后，添加生物炭后總糖、還原糖含量較低，但調制后，添加生物炭越多，總糖、還原糖含量也越高，由此說明添加生物炭有利于煙葉淀粉的積累和轉化。添加生物炭后，煙葉的總氮、煙堿含量增加，且調制后的差異變小，這可能是添加生物炭后，活化了土壤養分，更利于營養物質的吸收及轉化，進而最終改善煙葉品質。

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Effects of Biochar on Carbon and Nitrogen Metabolism of Flue-cured Tobacco

ZHANG Jia-wei1, YANG Yong-xia1, FENG Xiao-hu2, JIA Hong-fang1,ZHANG Song-tao1, ZHANG Hong-ying1, Cui Hong1*

(1. Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China;2. Fuzhou Tobacco Company of Jiangxi Province, Fuzhou 344000, China)

:In order to identify the effects of biochar on carbon and nitrogen metabolism of flue-cured tobacco, taking the tobacco variety (NicotianatabacumL, K326) as material, conducted the systematic research from the cell tissue structure, gene expression and metabolism in three levels. Results showed that the starch were more at the earlier stages, and degraded more completely in the treatment of no applying biochar with leaf maturity. The analysis of gene expression displayed that the expression of the genes related to carbon metabolism increased gradually after topping, while the expression of the genes related to nitrogen metabolism reduced. The expression of the genes were higher by applying more biochar at the later stages. The analysis of substance contents indicated that the contents of total sugar and reducing sugar reduced after applying biochar, the contents were higher after cured. The starch contents were higher after applying 600 kg/hm2. The contents of total nitrogen and nicotine increased after applying biochar, the difference was diminished after cured, these results showed that the metabolism of tobacco carbon and nitrogen were affected by applying biochar, thus affected the quality of flue-cured tobacco.

Flue-cured tobacco; Carbon and nitrogen metabolism; Biochar; Gene expression

2015-10-26

中國煙草總公司特色優質煙葉開發重大專項濃香型項目(110201101001 TS-01);江西煙葉物質代謝規律及調控研究(201201003)。

張嘉煒(1990─)，女，河南鄭州人，碩士研究生，研究方向：煙草生物技術。*通訊作者：崔紅。

S572

A

1001-8581(2016)03-0001-06

曾小軍)