分光光度法在食品蛋白質中二硫鍵含量測定中的應用

2016-05-04 02:51:04平秋婷

現代食品 2016年18期

◎ 平秋婷

（廣東省生物工程研究所（廣州甘蔗糖業研究所），廣東廣州 510000）

蛋白質是一種非常重要的生物大分子，其能夠存在于一切生物體內中，是細胞最主要的一種成分，同時也是生命體的基礎構成物質，屬于天然的表面活性劑和營養物質[1]。但蛋白質的結構卻非常容易因二硫鍵而受到影響，并且蛋白質的結構還可能致使蛋白質的表面活性因此發生改變[2]。鑒于此，本研究用分光光度法對食品蛋白質的二硫鍵含量進行測定，旨在進一步了解蛋白質的性能和結構關系，尤其是蛋白質結構與活性性能之間的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

從市面上購入新鮮豆漿。所需試劑有尿素、十二烷基硫酸鈉、EDTA、無水亞硫酸鈉、濃鹽酸和三氨基甲烷等。所需儀器有pH計（METTLER TOLEDO，Seven Easy）、紫外可見光光度計（島津，UV-2550）。

1.2 方法

1.2.1 制備NTSB

取1 mol/L亞硫酸鈉溶液10 mL與100 mg Ellment試劑充分混合，在38 ℃條件下通入氧氣直至顏色從亮紅色轉變為淡黃色，即表示完成NTSB試劑制備。

1.2.2 豆漿中二硫鍵含量測定

①取豆漿置于試管中，將試管口堵上，對其進行熱處理。向試管內加入20 mL豆漿，將塞子擰緊，將其放置在95 ℃條件下進行水浴處理，持續90 min，對其連續進行3次重復處理。②各取2 mL（1號）與4 mL（2號）樣品，并向其中分別加入18 mL與16 mL丙酮，充分搖勻，放置10 min，再行15 min離心處理，再加入丙酮10 mL行懸浮沉淀處理，再進行15 min的離心處理，重復2次。③取20 mL緩沖液（尿毒8 mol/L，1%SDS，EDTA 3 mmol/L，0.2 mol/L Tris-HC1，0.1 mol/L Na2SO3）加入到1號處理后豆漿中，另取20 mL緩沖液（尿毒 8 mol/L，1%SDS，EDTA 3 mmol/L，0.2 mol/L Tris-HC1）加入到2號處理后豆漿中。對其進行充分的振蕩處理，使其能夠完全溶解混合。④分別取 0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mL和 1.50 mL的 1號溶液置于試管中，再對各試管分別進行3次測試取平均值，取緩沖液（尿毒8 mol/L，1%SDS，EDTA 3 mmol/L，0.2 mol/L Tris-HC1，0.1 mol/L Na2SO3，10 mmol/L 5，5'-二硫代-2-硝基苯甲酸）相同劑量，加入到試管中，再取緩沖液（尿毒8 mol/L，1%SDS，EDTA 3 mmol/L，0.2 mol/L Tris-HC1，0.1 mol/L Na2SO3）將其稀釋到3 mL，即可行吸光度測定。⑤分別取0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mL和1.50 mL的1號溶液置于試管中，再對各試管分別進行3次測試取平均值，取緩沖液（0.2 mol/L Tris-HC1，10 mmol/L 5，5'-二硫代-2-硝基苯甲酸）0.1 mL加入中，對其進行30 min的振蕩處理，再次向其中加入緩沖液（尿毒8 mol/L，1%SDS，EDTA 3 mmol/L，0.2 mol/L Tris-HC1）將其稀釋到3 mL，即可行吸光度測定。

1.2.3 巰基和二硫鍵含量計算公式

當pH值達到8時，N TB的摩爾消光系數為13 600 mol/L·cm。