BD在奈瑟腦膜炎雙球菌傳代培養中的比較研究

摘要：目的 探索A群C群腦膜炎球菌多糖疫苗生產中奈瑟腦膜炎雙球菌傳代培養的最適培養基。方法 用BD代替酸水解酪蛋白制備相應的培養基，傳代培養4～5 h，以收獲菌體量來確定較好培養基配比。結果 BD用于A群C群奈瑟腦膜炎菌培養細菌數高，能穩定提高奈瑟腦膜炎雙球菌的產量。結論 BD可作為A群C群奈瑟腦膜炎雙球菌培養的最適培養基。

關鍵詞：BD；奈瑟腦膜炎雙球菌；培養菌數

The Study about BD in the Medium of Neisseria Menigitids

FENG Jun-ping， XIE Peng，SUN Yi-mei，CHEN Zuo-jiang YANG Ming， LI Guo-yan

（Lanzhou Institute of Biological Products Co.，Ltd ， Center for Gansu Provincial Vaccine Engineering Research，Lanzhou730046，Gansu，China）

Abstract：Objective To explore the optimal medium for culture of the meningococas polysaccharide vaccine.Methods The caseinic acid of BD medium was changed， The Neisseria meningitids was cultived for four-five hours. And the bactertrial to determine the best formulation of the medium was harvested .Results The caseinic acid of BD medium have the advantages of good culture. Conclusion The caseinic acid of BD medium is one of good formulation mediums in cultiving Neisseria meningitids .we should exchange the chemical composition of medium with the Bacterium changed.

Key words：Caseinic acid of BD；Neisseria menigitids ； Bacterial concentration

流行性腦膜炎是由奈瑟腦膜炎雙球菌引起的急性呼吸道傳染病。該病傳染性強，起病急，病情發展快和病死率高等特點。我國在大規模疫苗接種后，大大降低流腦的發病率[1]。隨著流腦在病原方面變化[2]，須接種A+C群流腦多糖疫苗來預防流腦的流行。為了選擇培養腦膜炎雙球菌最適宜的培養基，本實驗采用調整某些培養基成分來觀察細菌培養結果。

1資料與方法

1.1一般資料

1.1.1培養基 基礎培養基：酵母浸出粉（生物級）0.2%；磷酸二氫鉀（AR）0.02%；磷酸氫二鈉（AR）0.1%；氯化銨（AR）0.125%；甘氨酸（AR）0.01%；L-谷氨酸鈉（AR）0.1%；硫酸鎂（AR）0.06%；葡萄糖（AR）1%。

酸水解酪蛋白：A：法國Solabia 2.2%，批號：5042767識別碼Y120150158，有效期：2019年12月31日；B：美國BD：1.32%，批號：4195668，有效期：2019年05月；C：50%鹽酸水解酪蛋白液（自制）：1.2AN%，批號：20080309，有效期：2013年3月23日。

實驗組：S（1）號培養基：基礎培養基+酸水解酪蛋白（法國Solabia）；BD（2）號培養基：基礎培養基+酸水解酪蛋白（BD）；Y（3）號培養基：基礎培養基+50%鹽酸水解酪蛋白液（自制）。

1.1.2菌種 試驗用腦膜炎球菌的菌號：A群：CMCC 29201 （A4）菌株；C群：CMCC 29205（C11）菌株。來自中國生物制品研究院。

1.1.3反應罐 培養基制備罐：型號：MPS30L Applikon 30L Holland

1.2方法

1.2.1培養基制備[3-7] 開啟全自動配制罐，按1.1.1項配方制備基礎培養基和實驗組培養基，在適宜的配制溫度，攪拌轉速下溶解。澄清過濾分裝待用。

1.2.2菌種傳代培養 將A群和C群菌種開啟后，接種于10%羊血瓊脂培養基上，35～37℃，CO2環境培養12～20 h，刮取鏡檢合格菌苔接種于腦膜炎球菌多糖疫苗培養基擴增8～12 h后同上法轉種于發酵罐（30 L）。

1.2.3細菌的發酵培養及濃度的測定和形態觀察 培養中取樣測定細菌濃度及革蘭染色顯微鏡觀察，了解細菌生長情況，并適時調整各項參數。

2結果

按照流腦深層培養工藝培養[8]：

2.1不同配方培養基中培養基滲透壓比較 從表1可見，在A群和C群的培養基中，配方1的滲透壓高于配方3的滲透壓，配方2的滲透壓不高于前兩者，同種配方培養基滲透壓基本相同。

2.2不同配方培養基中細菌復蘇生長情況 從表2可見，按同一濃度接種，在相同的培養條件下：隨著培養時間的延長，配方3培養的細菌數量增加緩慢；而配方1和配方2培養的細菌數量迅速增長，配方2的細菌數增長速度快于配方1；提示配方2更有利于A群和C群腦膜炎球菌細菌生長。

2.3 不同工藝下細菌復蘇情況比較 從表3中表明：在A群或C群的培養中，（BD）酸水解酪蛋白培養基采用高壓滅菌或除菌過濾兩種工藝中差異不明顯，都能用于培養基制備。復蘇該菌時除菌過濾的成功率略高于高壓滅菌，P<0.05。說明除菌過濾后的培養基成分較能有效的復蘇腦膜炎球菌。

2.5培養基成分中氨基氮與氯化鈉的比較。

3討論

在進行微生物的培養中，適宜的培養基成分，能有效的提供細菌生長所需的碳源，氮源等營養。奈瑟腦膜炎球菌多糖疫苗原液體培養基是經典的配方，但隨著細菌傳代次數的增多及一些理化性狀的變化，原配方有時不能適應新的培養。這次研究表明流腦的培養基成分中改良的酸水解酪蛋白（BD）能為細菌提供蛋白質、多肽、核苷酸、充足的游離氨基酸、維生素B族及生長因子等，這些成分有利于細菌傳代生長發育。這種試驗既有利于提高培養基質量又有利于培養基的商品化生產。

參考文獻：

[1]胡緒敬，流腦流行的檢測與預防[J].中國公共衛生，2004，20（5）：638-640.

[2]衛生部.2006年全國法定傳染病疫情.[EB/OL]衛生部，中華人民共和國.http：//www.chinadcn.net.cn/c272442/n272530/n272757.16423.html.

[3]陳天壽，主編.微生物培養基制造與應用[M].第1版.北京：中國農業出版社，1995.

[4]紀紹梅，主編.微生物培養基質控與圖解[M].第1版.北京：北京科學技術出版社，2006.

[5]李國宴，孫一枚，楊勇，等.腦膜炎奈瑟氏菌培養結果與培養基質量指標的關系研究[C].第十次全國生物制品學術會議論文匯編，2009：119-122.

[6]楊建勇，劉梅影，林云，等.W135群腦膜炎球菌發酵工藝的研究[J].微生物學免疫學進展，2005，33（30：19-24.

[7]李國宴，孫一枚，吳衛堅，等.腦膜炎球菌多糖疫苗培養基的標準化研究[J].微生物學免疫學進展，2012，40（2）：26-29.

[8]中國生物制品標準化委員會編.中國生物制品規程2000版[S].化學工業出版社，2000：249-250.

編輯/孫杰