兩種方法對產粘液型銅綠假單胞菌的藥敏試驗探討

摘要：目的 通過兩種方法對產粘液型銅綠假單胞菌的藥敏試驗進行分析和探討。方法 應用紙片法來檢測產粘液型銅綠假單胞菌的藥敏試驗，同時應用Vitek 2全自動化細菌鑒定藥敏儀進行檢測，比較兩種方法的相關性。結果 158株產粘液型銅綠假單胞菌的藥敏試驗紙片法和儀器法大多數的藥物還是存在顯著性差異。結論 儀器法的結果還是不可靠，建議采用紙片法或其他MIC方法來檢測產粘液型銅綠假單胞菌的藥敏。

關鍵詞：產粘液型銅綠假單胞菌；Vitek 2；全自動化細菌鑒定藥敏儀；紙片

產粘液型銅綠假單胞菌是引起支氣管炎、慢性支氣管炎、支氣管擴張并感染的重要病原菌之一。由于細菌的黏膜表面形成大量粘液-多糖藻酸鹽等，從而持續定植、形成生物膜。慢性支氣管炎急性發作患者的咯痰涂片可見銅綠假單胞菌形成大量微小的生物膜碎片，其周圍有大量游離的裸菌。裸菌可刺激呼吸道黏膜造成感染性炎癥[1]。由于臨床分離到的產粘液型銅綠假單胞菌呈上升趨勢，而我們用常規方法不易鑒定細菌和報告藥敏試驗，為此我們嘗試采用了一種新型的肉湯稀釋法與常規的藥敏紙片法同時檢測臨床分離的158株菌株進行鑒定和藥敏分析，現將結果報告如下：

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1菌株 來自臨床分離的158株產粘液型銅綠假單胞菌。均來自痰標本，質控菌株大腸埃希氏菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.1.2試劑與儀器 哥倫比亞血瓊脂和麥康凱、M-H瓊脂購自伊華科技有限公司，氧化酶試劑和肉湯購自美國的Sigma公司，藥敏紙片購自英國的Oxoi公司，Vitek 2全自動化細菌鑒定藥敏儀購自法國生物梅里埃公司。

1.2方法

1.2.1菌株鑒定 大多數患者分離到的產粘液型銅綠假單胞菌在哥倫比亞血平板上35℃培養18～24 h，可見無色無味、露滴狀、邊緣不規則、不溶血的小菌落。48 h菌落融合為粘稠、膠凍樣菌落，部分患者的菌株為淡綠色，溶血可有可無。在麥康凱平板上35℃培養18～24 h菌落為無色無味、粘稠、膠凍樣、成片狀的大菌落，用接種環不易挑起[2]。培養48 h部分患者菌株的菌落可有淡綠色或淺褐色。氧化酶試驗均成陽性，這就可以初步區分下肺炎克雷伯菌（也會有粘液形成，但氧化酶陰性）。用無菌棉棒刮取在血平板上的產粘液型銅綠假單胞菌純菌落加入營養肉湯中制作菌懸液，將菌懸液管反復顛倒振搖，置于35℃培養18～24 h，然后取上清液制成0.5麥氏單位菌懸液，用VITEK2的GN卡鑒定。

1.2.2藥敏試驗 對分離到的158株產粘液型銅綠假單胞菌紙片擴散法在M-H上進行藥敏試驗，判斷標準按照CLSI M100-S24標準執行。同時在VITEK2 上用配套的AST-GN13藥敏卡嚴格按照儀器使用說明書進行藥敏測定。

2 結果和分析

2.1兩種方法檢測158株產粘液型銅綠假單胞菌的藥敏結果，見表1。

2.2兩種方法的檢測結果的統計學分析（SPSS），見表2。

我們通過軟件SPSS分析了各組的藥敏結果，從表2中我們可以看到氨曲南、頭孢吡肟、頭孢他啶、慶大霉素、左氧氟沙星的P<0.05，說明有顯著性差異。余下的阿米卡星、環丙沙星、亞胺培南、特治星、妥布霉素的P>0.05，說明無顯著性差異。

3 討論

產粘液型銅綠假單胞菌自然存在的一種特殊形式，其在黏膜表面產生大量粘液--多糖藻酸鹽等，從而持續定植、形成生物膜[3]。產粘液型銅綠假單胞菌在長期慢性呼吸道感染的患者痰標本中檢出率高，準確及時的藥敏結果更加重要。由于產粘液型銅綠假單胞菌的粘液使該菌生長明顯減慢，一般都需要48 h才生長，并且在生理鹽水中不容易形成均勻的菌懸液，使我們在上機鑒定和藥敏試驗時，無法鑒定或者結果不準確。故我們在轉純的時候采用哥倫比亞血瓊脂，且生長良好。菌懸液的制備也是采用肉湯使其生長良好而容易鑒定。

我們在采取兩種方法檢測產粘液型銅綠假單胞菌的藥敏時發現敏感組基本差異不大，P=0.649，說明兩種方法的結果無差異。而在中介組，P=0.003，說明結果有顯著差異。耐藥組P=0.040，顯示結果有顯著差異。這些結果可以這樣認為產粘液型銅綠假單胞菌，如果是機器檢測藥敏的話，結果不是很可靠，可能是生長不良的原因，有些耐藥的結果變成中介了，至于敏感的菌株，不管你生長好或是不好，只要對照孔生長，機器肯定會出現敏感的結果，和紙片法應該是符合一致的，所以我們建議采用紙片法或者其他MIC法的方法來檢測產粘液型銅綠假單胞菌的藥敏。

在我院分離到的產粘液型銅綠假單胞菌對10種常見的抗生素敏感性高，見表1，耐藥性較弱，但在治療產粘液型銅綠假單胞菌引起的感染時，往往臨床反映效果不佳，我們應考慮藻酸鹽對銅綠假單胞菌生物膜的形成的耐藥性。如果由于生物被膜的作用而難以完全清除的話，就容易在體內寄居，這樣就很容易誘發再次感染，而且反復的誘發以及反復的抗感染治療，就容易導致耐藥的形成，很強的定植和粘附能力，以及加上耐藥的形成，一旦再次繼發感染的話，治療就更加困難。據小林宏行報道大環內酯類藥物可通過抑制藻酸鹽合成酶而減少細菌藻酸鹽的分泌破壞細菌生物被膜的結構增加其他抗菌藥物對細菌生物被膜滲透從而達到與其他抗菌藥物聯合殺菌的目的[4]。

體內的研究發現大環內酯類抗生素能使生物膜的表面形成孔穴，從而使生物膜內部細菌得以暴露，有利于敏感藥物進入生物膜內部殺滅細菌。大環內酯類抗生素可使體內藻酸鹽免疫復合物逐漸下降，可有效地抑制由藻酸鹽介導的抗原抗體反應。大環內酯類抗生素尚有免疫調節作用，能有效地增強中性粒細胞對銅綠假單胞菌生物膜的吞噬作用；最新的研究發現克拉霉素能明顯抑制銅綠假單胞菌菌毛的顫動從而抑制銅綠假單胞菌的致病力，總之，我們認為大環內酯類抗生素在治療銅綠假單胞菌生物膜感染中具有舉足輕重的作用，而這種作用是其他藥物所不具備的[5]。

參考文獻：

[1]李彤，莊輝.細菌生物膜的研究進展[J].中華微生物學和免疫學雜志，2002，22（3）：343-346.

[2]周庭銀，趙虎.臨床微生物學診斷與圖解[M].上海：上海科學技術出版社，2001：141.

[3]大垣憲隆，太田見宏，小林宏行.細菌感染癥一最新化學療法[J].臨床微生物，1994，21（1）：51.

[4]小林宏行.細菌生物被膜的基礎與臨床[J].中國臨床藥理學雜志，1999，15：299-307.

[5]范春，牛其昌，王穎.銅綠假單胞菌生物膜耐藥性機制及防治[J].國外醫藥抗生素分冊，2004，25（5）：230-232.編輯/翟辰萬