復方鈣片中維生素D3的含量測定

摘要：目的 建立高效液相色譜法測定復方鈣片中維生素D3的含量。方法 采用Venusil MPC18（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱；流動相：甲醇；流速：1 ml/min；檢測波長：265 nm；柱溫：25℃；進樣量：20 μl。結(jié)果 維生素D3在0.6～3.0 μg/ml的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，平均回收率為98.62%。結(jié)論 本實驗建立的高效液相色譜法快速，簡便，準確，可用于復方鈣片中維生素D3的含量測定。關(guān)鍵詞：維生素D3；高校液相色譜法；含量測定

維生素D為固醇類衍生物，具抗佝僂病作用，又稱抗佝僂病維生素。它可以幫助人體更好地吸收鈣，增強骨骼韌性和密度，預防骨質(zhì)疏松，此外還能預防很多慢性病像癌癥，糖尿病，風濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化，自體免疫等疾病[1-3]。人體所需鈣量因年齡、生理及病理等不同而異。人們可以根據(jù)自己的需求適當補充維生素D和鈣。維生素D3是維生素D家族中的重要成員。實驗室前期制備了維生素D3和鈣的復方制劑，為了控制該制劑中維生素D3的質(zhì)量，建立了高效液相色譜法測定維生素D3的含量。

1儀器與試藥

Agilent1100高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；KQ5200超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；RJ-TGL-16C臺式高速離心機（無錫市瑞江分析儀器有限公司）；復方鈣片（本院自制）；維生素D3對照品（1000611-200607，中國藥品生物制品檢定所）；甲醇、乙醇均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：Venusil MPC18（4.6×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇；流速：1 ml/min；檢測波長：265 nm；柱溫：25℃；進樣量：20 μl。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備 精密稱取5 mg的維生素D3對照品置于250 ml的棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，使成為20 μg/ml的對照品溶液。精密吸取該對照品溶液3 ml置于50 ml棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得1.2 μg/ml的對照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 取本品20片放入研缽中研細成粉末，取粉末適量，精密稱定后放入50 ml錐形瓶中，加入10ml乙醇，稱重，浸潤10 min后超聲20 min，補足減失的重量。將溶液轉(zhuǎn)移至離心管，放置離心機中以4000 r/min離心5 min。取離心后的上清溶液，作為供試品溶液。

2.2.3陰性對照品溶液的制備 照復方鈣片的制備工藝制備不含維生素D3的空白片，取該片適量放入研缽中研成粉末，以下操作同2.2.2項下供試品溶液的制備方法，制得陰性對照品溶液。

2.3系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各20 μl，按2.1項下的色譜條件進樣，記錄色譜圖，見圖1。結(jié)果顯示供試品溶液在與對照品溶液色譜圖相應(yīng)的位置上有相同保留時間的色譜峰，且被測成分與相鄰雜質(zhì)峰分離良好。

2.4線性關(guān)系考察 分別吸取20 μg/ml對照品溶液0.3 ml、0.5 ml、0.8 ml、1.0 ml、1.2 ml、1.5 ml至10 ml棕色量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，按2.1項下的色譜條件進行測定。以峰面積為縱坐標（Y），以對照品溶液的濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，得維生素D3的回歸方程為Y=66.16 X-1.910，r=0.9995。結(jié)果表明維生素D3在0.6～3.0μg/ml的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液，連續(xù)進樣6次，測定峰面積。結(jié)果顯示峰面積的RSD為0.50%，表明精密度良好。

2.6重復性試驗 取同一樣品，精密稱取6份，按2.2.2項下供試品溶液的制備方法制備成溶液，進樣，結(jié)果顯示峰面積的RSD為1.89%，表明重現(xiàn)性良好。

2.7穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別在棕色瓶中室溫放置0 h、2 h、5 h、7 h、8 h后進樣，測定峰面積。結(jié)果顯示峰面積的RSD為0.64%。表明供試品溶液在8 h內(nèi)有良好的穩(wěn)定性。

2.8回收率實驗 按處方比例稱取原料藥，將維生素D3分高、中、低三個劑量加入到空白輔料中。然后按供試品溶液的提取方法提取維生素D3計算回收率。結(jié)果平均回收率為98.62%，RSD為2.02%，見表1。

2.9樣品含量測定將三批復合鈣片進行研磨成粉，取適量精密稱定，按供試品溶液的制備方法進行處理。平行操作三份，見表2。

3討論

為了確定輔料是否影響維生素D3的吸收，本實驗制備了不含維生素D3的陰性樣品溶液，在265 nm波長下檢測，進樣后觀察，在與對照品保留時間相同的位置無吸收峰出現(xiàn)，見圖1 C。因此本實驗選擇265 nm作為測定波長，與歷士旺等[4]選擇波長不同。

依據(jù)參考文獻[5]，本實驗考察了甲醇：水（95：5）作為流動相時的色譜系統(tǒng)，出峰時間較長，后調(diào)節(jié)甲醇的比例，發(fā)現(xiàn)改用甲醇作為流動相時，在15 min以內(nèi)出峰，且峰形較好。

本實驗在實驗過程中考察了提取溶劑（甲醇、乙醇、氯仿）、超聲時間（10 min、15 min、20 min、30 min）、提取次數(shù)（一次、兩次、三次）對維生素D3提取效率的影響，結(jié)果表明采用乙醇、超聲時間20 min、提取次數(shù)為一次時維生素D3的峰面積達到最大值。

本實驗建立的高效液相色譜法方法簡便易行，重現(xiàn)性好，結(jié)果準確，可用于復合鈣片中維生素D3的含量測定。

參考文獻：

[1]時超玲，李社莉.維生素D及其類似物在1型糖尿病防治中的應(yīng)用前景[J].醫(yī)學綜述，2014，20（11）：2028-2030.

[2]周靜，王晉平，周孝德，等.骨化三醇在類風濕關(guān)節(jié)炎合并骨質(zhì)疏松中的作用研究[J].中華臨床醫(yī)師雜志，2013，7（24）：116-119.

[3]Sarah Hewer，Robyn Lucas，Ingrid van der Mei，et al.Vitamin D and multiple sclerosis[J].Journal of Clinical Neuroscience，2013，20，634-641.

[4]歷士旺，趙亞平，張亞鋒，等.HPLC法測定鈣-D顆粒中維生素D3的含量[J].西北藥學雜志，2003，18（1）：3-4.

[5]邵耀東，趙小華，胡彬，等.利用酶解法測定復合維生素溶液中維生素D3含量的研究[J].畜牧與獸醫(yī)，2012，44（1）：61-63.

編輯/申磊