一步法RT-PCR快速檢測豬瘟活疫苗中BVDV外源病毒方法的建立

李天芝，于新友，沈志強(.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 56600；.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 56600)

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一步法RT-PCR快速檢測豬瘟活疫苗中BVDV外源病毒方法的建立

李天芝1，于新友1，沈志強2
(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600)

摘 要：為檢測商品化豬瘟細胞毒活疫苗中牛病毒性腹瀉病毒污染，根據牛病毒性腹瀉病毒5′端非編碼區基因保守序列設計引物，建立了檢測牛病毒性腹瀉病毒一步法反轉錄—聚合酶鏈(RT-PCR)方法，并對其特異性、敏感性進行了研究。該一步法RT-PCR對牛病毒性腹瀉病毒擴增結果為陽性，對照毒株擴增結果均為陰性，對牛病毒性腹瀉病毒檢測的靈敏性為1pg總RNA量，應用該方法，檢測了32批豬瘟細胞毒活疫苗樣品，以上結果表明該一步法RT-PCR方法檢測速度快、特異性強、敏感性高，可用于豬瘟細胞毒活疫苗中污染的牛病毒性腹瀉病毒外源病毒檢測。

關鍵詞：豬瘟；牛病毒性腹瀉病毒；檢測

豬瘟(CSF)由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種豬高度傳染、致死性疾病，我國將豬瘟列為一類動物疫病[1]。牛病毒性腹瀉病(BVD)是由牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)引起的以發熱、黏膜糜爛潰瘍、腹瀉、咳嗽、持續性感染與免疫耐受以及懷孕母牛流產、畸胎甚至死胎等為主要特征的牛傳染病[2]，我國將牛病毒性腹瀉病列為禁止入境的二類檢疫對象。BVDV和CSFV同屬于黃病毒科瘟病毒屬中的成員，BVDV還可引起豬、駱駝、羊、鹿等多種動物感染發病[3]，給各國養殖業造成了嚴重的經濟損失。豬感染BVDV后可產生類似慢性豬瘟的臨床癥狀和病理變化，懷孕母豬可致發生流產，產出畸形胎兒，免疫BVDV污染的豬瘟細胞毒活疫苗是豬感染BVDV一種重要途徑。BVDV主要通過生產過程中使用的牛血清、胰酶、牛睪丸等材料以及容器、設備污染豬瘟細胞活疫苗。對豬感染BVDV的現狀必須有清醒的認識和必要的防控措施。本研究根據GenBank公布BVDV基因序列，針對具有很高保守性的5′端非編碼區基因設計1對特異性引物，建立了一種特異、敏感的BVDV檢測方法，以確保疫苗的安全、有效，為商品化豬瘟細胞毒活疫苗中BVDV污染提供一種有效的分子生物學檢測方法。

1　?材料和方法

1.1病毒株與病料

牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病毒、豬細小病毒、豬圓環病毒2型等均由本實驗室保存，32批豬瘟細胞毒活疫苗樣品購買自不同廠家。

1.2工具酶及試劑盒

AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒購自愛思進生物技術(杭州)有限公司、DNA Marker、PCR相關試劑、限制性內切酶、MD18-T載體、DNA凝膠回收試劑盒購自大連寶生物公司。

1.3RT-PCR引物設計與合成

參照GenBank中登錄的BVDV 5′端非編碼區序列，設計1對引物，上游引物：5′-AGGCTAG CCATGCCCTTAGT-3′，下游引物：5′-TCTGCAGCACCCTAT CAGG-3′，擴增BVDV 5′端非編碼區序列244 bp，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.4病毒基因組RNA的提取

按AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒使用說明書提取BVDV的RNA，并提取其他幾種病毒的RNA。

1.5一步法 RT-PCR擴增及條件優化

以RNA為模板進行一步法RTPCR擴增，反應體系為20 μL。各參數為50℃逆轉錄30 min，95℃預變性3 min，然后進入95 ℃ 20 S、56 ℃20 S、72 ℃ 20 S，共35個循環，最后72 ℃延伸8 min。取5 μL產物，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。同時對各擴增條件進行優化，包括退火溫度(50～60 ℃梯度溫度，每2 ℃為1個梯度)、引物濃度(0.1～1.1μmol/L，每0.2μmol/L為1個梯度)等，反應體系均為20μL。

1.6擴增產物的檢測及鑒定

首先取擴增產物5μL在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。將目的片段與pMD18-T克隆載體在16 ℃恒溫金屬浴中過夜連接，轉化感受態菌株DH5α。挑取單個的轉化菌落，加LB溶液培養18 h后用質粒提取試劑盒抽提質粒，用PCR方法進行鑒定，將陽性克隆送上海生工生物工程股份有限公司進行測序鑒定，將測序結果與參照的BVDV序列同源性比較。

1.7特異性試驗

分別提取牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病毒、豬細小病毒、豬圓環病毒2型的RNA，用已建立的方法進行擴增。

1.8敏感性試驗

BVDV 病毒提取RNA后定量，然后10倍梯度稀釋提取的病毒基因組RNA，使其分別相當于含有10 ng RNA、1 ng RNA、100 pg RNA、10 pg RNA、1 pg RNA、0.1 pg RNA的含量，分別進行一步法RT-PCR檢測，確定其敏感性。

1.9重復性試驗

用建立的一步法RT-PCR檢測方法，檢測3份牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病毒、豬細小病毒、豬圓環病毒2型，重復檢測3次，以驗證本方法的重復性和穩定性。

1.10豬瘟細胞毒活疫苗中BVDV外源病毒的檢測

將購買的32批豬瘟細胞毒活疫苗樣品稀釋為含有1頭份/200μL作為檢測樣品進行一步法RT-PCR擴增BVDV，同時設立陽性對照和陰性對照。并同時參照相關規程用細胞培養法檢驗并比較二者的符合性。

2　?結果與分析

2.1擴增產物的檢測及鑒定

PCR擴增產物經過1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在244 bp處可見特異性擴增帶，與預期大小相符(圖1)。挑取PCR鑒定陽性的菌液送上海生工生物工程股份有限公司測序。測序結果顯示，插入到T載體的基因片段的核苷酸序列與BVDV(登錄號：KJ620017)的序列相似性為100%。

圖1　牛病毒性腹瀉病毒擴增結果

2.2特異性試驗

利用設計的引物和確定的最佳擴增條件分別對牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病毒、豬細小病毒、豬圓環病毒2型的核酸進行一步法RT-PCR。結果6個樣品中只有BVDV能擴增出大小為244 bp目的片段，而其他均未擴增出相應的片段(圖2)，表明本試驗建立的方法有很好的特異性。

圖2　特異性試驗

2.3敏感性試驗

取5μ L PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，分別在約244 bp附近出現特異性條帶，與預期產物大小相符。從結果可以看出，引物的一步法RT-PCR檢測靈敏度可以達到1 pg RNA(圖3)。

圖3　敏感性試驗

2.4重復性試驗經過3次重復操作，結果一致，說明建立的方法是穩定、可靠的。

2.5豬瘟細胞毒活疫苗中BVDV外源病毒的檢測

用建立的BVDV 一步法 RT-PCR檢測方法，共檢測了32批商品化豬瘟細胞毒活疫苗樣品，其中有2批有BVDV污染。細胞培養法的檢測結果與一步法 RT-PCR檢測方法的結果相同。

3　討論

范學政等[4]用RT-PCR方法對23批次的豬瘟疫苗進行BVDV檢測，結果顯示，5批次豬瘟疫苗被BVDV污染，污染率達21.74%。范仲鑫等[5]用RTPCR方法對湖南省內銷售的10個廠家48個批次的豬瘟細胞苗進行BVDV病毒核酸檢測，結果：10個廠家的豬瘟細胞苗中有5個廠家檢出BVDV核酸陽性，48個批次中有9批次檢出BVDV核酸陽性，陽性率為18.75%。因此，必須對豬瘟活疫苗中的BVDV進行嚴格檢驗，禁止接種BVDV污染的豬瘟活疫苗，按照《中華人民共和國獸藥典》(2010年版3部)外源病毒檢驗方法，對豬瘟細胞毒活疫苗中BVDV外源病毒的檢驗主要采取細胞培養法，該法操作復雜，耗時間長，傳統的兩部法RT-PCR檢測方法時間長，操作繁瑣，需要先反轉錄成cDNA再進行PCR擴增，本試驗建立的BVDV一步法RTPCR檢測方法操作簡單，不需要單獨做反轉錄，反轉錄與PCR擴增一步完成，能在3 h內檢出BVDV，不僅節省了時間，而且減少了操作步驟，可方便快捷地擴增出目的片段，適合于大規模推廣應用。本試驗建立的BVDV一步法RT-PCR檢測方法，共檢測了32批商品化豬瘟細胞毒活疫苗樣品，其中有2批有BVDV污染，與細胞培養法檢測結果一致。本試驗所建立的方法為豬場基層獸醫工作者開展豬瘟細胞毒活疫苗樣品BVDV污染的檢測提供了一種簡單、有效的分子生物學檢測方法。

參考文獻

[1]國際獸疫局.哺乳動物，禽和蜜蜂A和B類疾病診斷試驗和疫苗標準手冊[M].3版.農業部畜牧獸醫局，譯.1996：128-135.

[2]殷震，劉景華.動物病毒學[M].2版.北京：科學出版社，1997：538-548.

[3]王新平，周緒斌.豬感染牛病毒性腹瀉病毒的研究進展[J].動物醫學進展，1998，19(1)：1-3.

[4]范學政，寧宜寶，王琴，等.用RTPCR方法檢測豬瘟細胞苗中污染牛病毒性腹瀉病毒[J].中國獸醫雜志，2010，46(1)：8-10.

[5]范仲鑫，張朝陽，劉道新，等.豬瘟細胞苗污染牛病毒性腹瀉病毒情況調查[J].畜牧與獸醫，2011，43(7)：84-86.

(收稿日期：2015-11-09)

作者簡介：李天芝(1985-)，女，助理研究員，碩士，主要從事動物傳染病診斷技術研究.

基金項目：山東省現代農業產業技術體系生豬產業創新團隊項目(SDAIT-06-011-14)；濱州市科技發展計劃項目(2013GG0304)