四川規模化豬場腹瀉仔豬病毒性腹瀉病原的分子檢測

蔡雨函，周遠成，艾 能，李 碧，潘 夢（四川華神獸用生物制品有限公司 四川省動物生物制品工程技術研究中心，四川 成都610299）

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四川規模化豬場腹瀉仔豬病毒性腹瀉病原的分子檢測

蔡雨函，周遠成，艾 能，李 碧，潘 夢
（四川華神獸用生物制品有限公司 四川省動物生物制品工程技術研究中心，四川 成都610299）

摘 要：為了解四川地區仔豬腹瀉中病毒性病原的感染情況，應用RT-PCR方法對來自四川不同地區的20個豬場的仔豬腹瀉病料進行了9種病毒性病原的檢測。結果顯示陽性率最高的為PRoV，其次為PKBV、PEDV、PBoV、PToV、MRV、AV、TGEV、PSaV&PNoV；檢測的這20份樣品中均存在混合感染的情況。

關鍵詞：仔豬腹瀉；病毒性病原；分子檢測

在集約化養豬生產條件下，仔豬腹瀉十分普遍，該病不僅會造成仔豬成活率下降，感染2周內仔豬發病率高達100%，死亡率在80%以上，而且還會造成生長發育受阻、飼料報酬降低等后果；且有報道表明，近年來因腹瀉死亡的仔豬占仔豬死亡總數38.9%[1]，嚴重威脅著養豬業的健康發展。為了了解四川地區仔豬腹瀉中病毒性病原的感染情況，本實驗集成了多種病毒性病原檢測方法對來自四川不同地區的20個豬場的仔豬腹瀉病料進行了RT-PCR檢測。

1　?材料與方法

1.1主要試劑

RNA提取試劑Trizol regment、反轉錄試劑盒、Hs-Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker等購于TAKARA(大連)。

1.2引物設計

本文所用引物如表1所示[2-3]，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3病料采集與處理

于2014年秋冬季節共收集來自四川省20個規模化豬場發生仔豬腹瀉的腸道或糞便樣品20份。取適量的組織樣品用剪刀剪碎后放入勻漿器里，加入1 mL PBS進行勻漿，勻漿充分后12 000 r/min，離心 10 min，取上清置-80 ℃保存；糞便樣品則轉移到離心管中，12 000 r/min離心10 min，取上清分裝后置-80 ℃保存。

1.4RT-PCR檢測

1.4.1總 RNA 的提取與 cDNA的合成

取200 μL上清液加入1 mL Trizol regment，反復顛倒混勻，室溫作用5 min后12 000 r/min離心10 min，吸取上清轉移到無RNAase的EP管中；加入200 μL氯仿，震蕩混勻并室溫靜置10 min后12 000 r/min離心10 min；取上清于新的無RNAase的EP管中，加入等體積的異丙醇沉淀RNA，室溫靜置10 min后12 000 r/min離心15 min，再用1 mL 700 mL/L冰乙醇洗滌1次；輕輕棄去剩余的無水乙醇，自然風干，加入20 μL 無RNAase雙蒸水，反復吹打以溶解RNA，同時加入RNAase抑制劑2 μL，-20 ℃保存備用。取無RNAase PCR管，加入隨機引物50 ng，總RNA 5 μL，混勻后68 ℃處理5 min，結束后迅速置冰上放置2 min，然后按照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA。

1.4.2PCR 擴增

按照Hs Taq說明書，采用25 μL反應體系，并參照參考文獻[2，3]的擴增程序進行PCR反應。PCR結束后取5μL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。

2　?實驗結果

RT-PCR擴增結果如表2所示，PEDV、TGEV、PRoV、PToV、P K B V、P B o V、A V、M R V、PSaV&PNoV陽性率分別為65%、20%、75%、40%、70%、55%、35%、35%、10%。其中感染陽性率最高的為PRoV，其次為PKBV、PEDV、PBoV、PToV、MRV、AV、TGEV、PSaV&PNoV。檢測的這20份樣品中存在多種病毒性病原混合感染的情況，感染最復雜的豬場可同時檢測到6種病毒性病原。有70% (14/20)的豬場存在PEDV/PRoV/ TGEV兩兩混合感染的情況，其中PEDV/PRoV兩兩感染的情況最為嚴重。

3　討論

仔豬腹瀉是一種典型的多因素性疾病，其發生率極高，能夠引起仔豬腹瀉的原因有很多，大致包括細菌、病毒及寄生蟲等傳染性因素及營養性腹瀉、應激因素等非傳染性因素，而由病毒引起的腹瀉發病急、傳播范圍廣、傳播速度快、危害最嚴重，因此是當前研究的重點[4]。目前許多病毒可致仔豬腹瀉，其中傳染性胃腸炎病毒(TGEV)流行性腹瀉病毒(PEDV)和輪狀病毒(RV)是引起仔豬病毒性腹瀉的 3 種主要病毒，病毒間常呈單獨感染或混合感染；而越來越多研究報道一些新的病毒與腹瀉有關，如環曲病毒(PToV)、嵴病毒(PKBV)、博卡病毒(PBoV)，星狀病毒(AV)等[5-6]。

為了了解四川省仔豬腹瀉中病毒性病原的感染情況，本實驗對20個豬場進行了9種病毒性腹瀉病原的檢測。結果顯示：PRoV陽性率最高為75%，其次則為PKBV、PEDV和PBoV，其陽性率分別為70%、65%和55%，其余5種病原陽性率均低于50%。許多對仔豬病毒性腹瀉流行病學調查表明PEDV的感染陽性率最高，是引起仔豬腹瀉的主要病原[7]，但本研究結果顯示PRoV檢測陽性率最高，其原因一方面可能是所選擇的檢測方法不同所引起：本實驗采用的是巢氏RT-PCR，而其他研究則多采用RT-PCR或能同時檢測多種病原的多重PCR，但巢氏RT-PCR的靈敏度通常要比普通PCR高100倍，另一方面可能是因為PRoV即是引起四川省2014年仔豬腹瀉最主要的病原。其次，新出現的病毒如PKBV和PBoV的陽性率也較高，但是對于仔豬腹瀉是否由這些新病毒引起的說法還需要進一步研究。

所有被檢豬場均存在混合感染的現象，其中只有3個豬場是2種病毒混合感染，其余均是3種以上病毒混合感染，而且還有2個豬場甚至達到6種病毒性病原混合感染，但在豬群腹瀉的發病過程中究竟是混合感染病毒中的一種起了主要作用，還是共同感染協同起作用，這個問題還有待于更進一步研究。在混合感染的豬場中，有70%的豬場存在PEDV/PRoV/TGEV兩兩混合感染的情況，表明當前防控PEDV、PRoV、TGEV仍是降低仔豬腹瀉發生率的關鍵問題。總之，在四川地區流行的仔豬病毒性腹瀉病例中，疾病感染情況非常復雜，這在生產養殖中對仔豬腹瀉防控增加了難度，而本實驗結果將有助于指導養殖場(戶)做好疫苗免疫與防控工作。

表2　RT-PCR檢測結果

參考文獻

[1]王明福，彭羽，肖光明.論溶菌酶防治仔豬大腸桿菌性腹瀉推廣應用前景[J].中國畜禽種業，2009(3)：132-135.

[2]ZHOU Y，CHEN L，ZHU L，et al.Molecular Detection of Porcine Torovirus in Piglets with Diarrhea in Southwest China[J].The Scientific World Journal，2013(5)： 984282.

[3]蔡雨函，朱玲，周遠成，等.豬博卡病毒雙重PCR檢測方法的建立及其應用[J].中國獸醫科學，2013，43(8)：833-838.

[4]田沖，歐陽金旭，羅碧毅，等.仔豬病毒性腹瀉的流行病學研究進展[J].長江大學學報自然科學版： 石油/農學(旬刊)，2013，10(2)： 57-60.

[5]單玉平，王益軍，董燕萍，等.新生仔豬腹瀉病的診斷及防控[J].畜牧獸醫科技信息，2014 (8)： 69-70.

[6]劉好朋，胡京京，賀東生.仔豬病毒性腹瀉分析及綜合防制措施[J].養豬，2014 (5)： 121-122.

[7]薛瑞雪，田野，田夫林，等.山東省部分地區仔豬病毒性腹瀉流行病學調查[J].中國預防獸醫學報，2015，37(4)：254-257.

(收稿日期：2015-07-09)

作者簡介：蔡雨函（1990-），女，四川南充人。通訊作者：周遠成，博士，主要從事動物傳染病病原分子生物學研究，E-mail：abtczyc@163.com