四川規(guī)?；i場(chǎng)腹瀉仔豬病毒性腹瀉病原的分子檢測(cè)

蔡雨函，周遠(yuǎn)成，艾 能，李 碧，潘 夢(mèng)（四川華神獸用生物制品有限公司 四川省動(dòng)物生物制品工程技術(shù)研究中心，四川 成都610299）

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四川規(guī)模化豬場(chǎng)腹瀉仔豬病毒性腹瀉病原的分子檢測(cè)

蔡雨函，周遠(yuǎn)成，艾 能，李 碧，潘 夢(mèng)
（四川華神獸用生物制品有限公司 四川省動(dòng)物生物制品工程技術(shù)研究中心，四川 成都610299）

摘 要：為了解四川地區(qū)仔豬腹瀉中病毒性病原的感染情況，應(yīng)用RT-PCR方法對(duì)來(lái)自四川不同地區(qū)的20個(gè)豬場(chǎng)的仔豬腹瀉病料進(jìn)行了9種病毒性病原的檢測(cè)。結(jié)果顯示陽(yáng)性率最高的為PRoV，其次為PKBV、PEDV、PBoV、PToV、MRV、AV、TGEV、PSaV&PNoV；檢測(cè)的這20份樣品中均存在混合感染的情況。

關(guān)鍵詞：仔豬腹瀉；病毒性病原；分子檢測(cè)

在集約化養(yǎng)豬生產(chǎn)條件下，仔豬腹瀉十分普遍，該病不僅會(huì)造成仔豬成活率下降，感染2周內(nèi)仔豬發(fā)病率高達(dá)100%，死亡率在80%以上，而且還會(huì)造成生長(zhǎng)發(fā)育受阻、飼料報(bào)酬降低等后果；且有報(bào)道表明，近年來(lái)因腹瀉死亡的仔豬占仔豬死亡總數(shù)38.9%[1]，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。為了了解四川地區(qū)仔豬腹瀉中病毒性病原的感染情況，本實(shí)驗(yàn)集成了多種病毒性病原檢測(cè)方法對(duì)來(lái)自四川不同地區(qū)的20個(gè)豬場(chǎng)的仔豬腹瀉病料進(jìn)行了RT-PCR檢測(cè)。

1　?材料與方法

1.1主要試劑

RNA提取試劑Trizol regment、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Hs-Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker等購(gòu)于TAKARA(大連)。

1.2引物設(shè)計(jì)

本文所用引物如表1所示[2-3]，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3病料采集與處理

于2014年秋冬季節(jié)共收集來(lái)自四川省20個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)發(fā)生仔豬腹瀉的腸道或糞便樣品20份。取適量的組織樣品用剪刀剪碎后放入勻漿器里，加入1 mL PBS進(jìn)行勻漿，勻漿充分后12 000 r/min，離心 10 min，取上清置-80 ℃保存；糞便樣品則轉(zhuǎn)移到離心管中，12 000 r/min離心10 min，取上清分裝后置-80 ℃保存。

1.4RT-PCR檢測(cè)

1.4.1總 RNA 的提取與 cDNA的合成

取200 μL上清液加入1 mL Trizol regment，反復(fù)顛倒混勻，室溫作用5 min后12 000 r/min離心10 min，吸取上清轉(zhuǎn)移到無(wú)RNAase的EP管中；加入200 μL氯仿，震蕩混勻并室溫靜置10 min后12 000 r/min離心10 min；取上清于新的無(wú)RNAase的EP管中，加入等體積的異丙醇沉淀RNA，室溫靜置10 min后12 000 r/min離心15 min，再用1 mL 700 mL/L冰乙醇洗滌1次；輕輕棄去剩余的無(wú)水乙醇，自然風(fēng)干，加入20 μL 無(wú)RNAase雙蒸水，反復(fù)吹打以溶解RNA，同時(shí)加入RNAase抑制劑2 μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈo(wú)RNAase PCR管，加入隨機(jī)引物50 ng，總RNA 5 μL，混勻后68 ℃處理5 min，結(jié)束后迅速置冰上放置2 min，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。

1.4.2PCR 擴(kuò)增

按照Hs Taq說(shuō)明書(shū)，采用25 μL反應(yīng)體系，并參照參考文獻(xiàn)[2，3]的擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR結(jié)束后取5μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶。

2　?實(shí)驗(yàn)結(jié)果

RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果如表2所示，PEDV、TGEV、PRoV、PToV、P K B V、P B o V、A V、M R V、PSaV&PNoV陽(yáng)性率分別為65%、20%、75%、40%、70%、55%、35%、35%、10%。其中感染陽(yáng)性率最高的為PRoV，其次為PKBV、PEDV、PBoV、PToV、MRV、AV、TGEV、PSaV&PNoV。檢測(cè)的這20份樣品中存在多種病毒性病原混合感染的情況，感染最復(fù)雜的豬場(chǎng)可同時(shí)檢測(cè)到6種病毒性病原。有70% (14/20)的豬場(chǎng)存在PEDV/PRoV/ TGEV兩兩混合感染的情況，其中PEDV/PRoV兩兩感染的情況最為嚴(yán)重。

3　討論

仔豬腹瀉是一種典型的多因素性疾病，其發(fā)生率極高，能夠引起仔豬腹瀉的原因有很多，大致包括細(xì)菌、病毒及寄生蟲(chóng)等傳染性因素及營(yíng)養(yǎng)性腹瀉、應(yīng)激因素等非傳染性因素，而由病毒引起的腹瀉發(fā)病急、傳播范圍廣、傳播速度快、危害最嚴(yán)重，因此是當(dāng)前研究的重點(diǎn)[4]。目前許多病毒可致仔豬腹瀉，其中傳染性胃腸炎病毒(TGEV)流行性腹瀉病毒(PEDV)和輪狀病毒(RV)是引起仔豬病毒性腹瀉的 3 種主要病毒，病毒間常呈單獨(dú)感染或混合感染；而越來(lái)越多研究報(bào)道一些新的病毒與腹瀉有關(guān)，如環(huán)曲病毒(PToV)、嵴病毒(PKBV)、博卡病毒(PBoV)，星狀病毒(AV)等[5-6]。

為了了解四川省仔豬腹瀉中病毒性病原的感染情況，本實(shí)驗(yàn)對(duì)20個(gè)豬場(chǎng)進(jìn)行了9種病毒性腹瀉病原的檢測(cè)。結(jié)果顯示：PRoV陽(yáng)性率最高為75%，其次則為PKBV、PEDV和PBoV，其陽(yáng)性率分別為70%、65%和55%，其余5種病原陽(yáng)性率均低于50%。許多對(duì)仔豬病毒性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查表明PEDV的感染陽(yáng)性率最高，是引起仔豬腹瀉的主要病原[7]，但本研究結(jié)果顯示PRoV檢測(cè)陽(yáng)性率最高，其原因一方面可能是所選擇的檢測(cè)方法不同所引起：本實(shí)驗(yàn)采用的是巢氏RT-PCR，而其他研究則多采用RT-PCR或能同時(shí)檢測(cè)多種病原的多重PCR，但巢氏RT-PCR的靈敏度通常要比普通PCR高100倍，另一方面可能是因?yàn)镻RoV即是引起四川省2014年仔豬腹瀉最主要的病原。其次，新出現(xiàn)的病毒如PKBV和PBoV的陽(yáng)性率也較高，但是對(duì)于仔豬腹瀉是否由這些新病毒引起的說(shuō)法還需要進(jìn)一步研究。

所有被檢豬場(chǎng)均存在混合感染的現(xiàn)象，其中只有3個(gè)豬場(chǎng)是2種病毒混合感染，其余均是3種以上病毒混合感染，而且還有2個(gè)豬場(chǎng)甚至達(dá)到6種病毒性病原混合感染，但在豬群腹瀉的發(fā)病過(guò)程中究竟是混合感染病毒中的一種起了主要作用，還是共同感染協(xié)同起作用，這個(gè)問(wèn)題還有待于更進(jìn)一步研究。在混合感染的豬場(chǎng)中，有70%的豬場(chǎng)存在PEDV/PRoV/TGEV兩兩混合感染的情況，表明當(dāng)前防控PEDV、PRoV、TGEV仍是降低仔豬腹瀉發(fā)生率的關(guān)鍵問(wèn)題。總之，在四川地區(qū)流行的仔豬病毒性腹瀉病例中，疾病感染情況非常復(fù)雜，這在生產(chǎn)養(yǎng)殖中對(duì)仔豬腹瀉防控增加了難度，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果將有助于指導(dǎo)養(yǎng)殖場(chǎng)(戶(hù))做好疫苗免疫與防控工作。

表2　RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

參考文獻(xiàn)

[1]王明福，彭羽，肖光明.論溶菌酶防治仔豬大腸桿菌性腹瀉推廣應(yīng)用前景[J].中國(guó)畜禽種業(yè)，2009(3)：132-135.

[2]ZHOU Y，CHEN L，ZHU L，et al.Molecular Detection of Porcine Torovirus in Piglets with Diarrhea in Southwest China[J].The Scientific World Journal，2013(5)： 984282.

[3]蔡雨函，朱玲，周遠(yuǎn)成，等.豬博卡病毒雙重PCR檢測(cè)方法的建立及其應(yīng)用[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2013，43(8)：833-838.

[4]田沖，歐陽(yáng)金旭，羅碧毅，等.仔豬病毒性腹瀉的流行病學(xué)研究進(jìn)展[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版： 石油/農(nóng)學(xué)(旬刊)，2013，10(2)： 57-60.

[5]單玉平，王益軍，董燕萍，等.新生仔豬腹瀉病的診斷及防控[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2014 (8)： 69-70.

[6]劉好朋，胡京京，賀東生.仔豬病毒性腹瀉分析及綜合防制措施[J].養(yǎng)豬，2014 (5)： 121-122.

[7]薛瑞雪，田野，田夫林，等.山東省部分地區(qū)仔豬病毒性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2015，37(4)：254-257.

(收稿日期：2015-07-09)

作者簡(jiǎn)介：蔡雨函（1990-），女，四川南充人。通訊作者：周遠(yuǎn)成，博士，主要從事動(dòng)物傳染病病原分子生物學(xué)研究，E-mail：abtczyc@163.com