化工廠廢水中對甲苯磺酸降解菌的篩選及降解特性研究

沈　潔，李加友，陸筑鳳，蔡麗玲（嘉興學院生化學院，浙江　嘉興　314001）

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化工廠廢水中對甲苯磺酸降解菌的篩選及降解特性研究

沈潔，李加友，陸筑鳳，蔡麗玲
（嘉興學院生化學院，浙江嘉興314001）

摘要：以對甲苯磺酸為唯一碳源，從化工廠供試廢水中篩選出對甲苯磺酸降解菌，經形態學觀察和分子生物學鑒定，確定這種菌株為哈茨木霉菌，命名為哈茨木霉1228。利用固態發酵的方法制備哈茨木霉1228，培養物直接投入化工廠供試廢水進行處理，結果發現：在pH=5、溫度30℃時，處理7 h后，化工廠供試廢水中對甲苯磺酸降解率可達45%。

關鍵詞：對甲苯磺酸；生物降解；哈茨木霉；降解特性

芳香族化合物作為一類重要的化工原料與中間體，正以每年百萬噸的數量被制造出來，它們廣泛用于有機合成、染料、塑料等行業。這類化合物有苯環或者多個苯環結構，具有相當大的毒性和致癌、致突變作用，且化學性質穩定，故其殘留在生態系統中，對環境和人類健康造成危害[1-2]。目前，國內外工廠對廢水中芳香族化合物的處理主要用物理化學方法，但大都存在運行費用高，處理效果不理想并且容易造成二次污染等諸多缺點。微生物降解環境污染物由于投資少、占地小又不需特殊設備而成為最有前途的治理環境污染的方法[3-4]。自然界中的許多好氧和厭氧微生物可以降解芳香族化合物[5-10]。

對甲苯磺酸是農藥、醫藥、染料及有機合成等工業生產中的中間體原料，已廣泛應用于制備樹脂的固化劑和有機合成反應的催化劑[11]。對甲苯磺酸具強刺激性，對水體和大氣都會造成污染，吸入、攝入或經皮膚吸收后都會對人體健康造成危害。化工廠廢水中，因對甲苯磺酸的含量較高，廢水酸性強，工廠常規的處理方法無法達到理想效果；且廢水中含鹽量大，菌種不易生長降解。本研究主要通過自然選育法從化工廠供試廢水中選育出對甲苯磺酸降解菌，并考查其直接投菌的處理化工廠供試廢水時的降解特性，為化工廠含甲苯磺酸廢水的修復處理提供理論依據。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1供試廢水

采自浙江嘉化能源化工股份有限公司化工廠含有對甲苯磺酸的未經處理的廢水。

1.1.2主要儀器及化學試劑

主要儀器：液相色譜儀（1200 series，美國Agilent）、氣質聯用儀（7890A-5975C，美國Agilent）、恒溫震蕩搖床（QYC-211，上海福瑪實驗設備有限公司）、高速離心機（TD5A-WS，長沙湘儀離心機儀器有限公司）

化學試劑：對甲苯磺酸（浙江嘉化能源化工股份有限公司化工廠生產，純度≧98%），其余化學試劑均為分析純試劑。

1.1.3培養基

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3 g，蛋白陳10 g，NaCl 5 g，瓊脂15～20 g，H2O 1000 mL，pH 7.2～7.4。

PDA養基：土豆100 g，蔗糖20 g，瓊脂15～ 20 g，H2O 1000 mL，自然pH。

無糖無機鹽培養基：Na2NO33 g，K2HPO41 g，MgSO40.5 g，KCl 0.5 g，FeSO40.01 g，瓊脂15～ 20 g，H2O 1000 mL，pH 7.2～7.4。

1.2實驗方法

1.2.1對甲苯磺酸降解菌的篩選

從供試廢水中篩選出降解對甲苯磺酸的活性菌株。具體方法如下：供試廢水經適當稀釋，在牛肉膏蛋白胨培養基或PDA培養基（含有1 g·L-1的對甲苯磺酸）平板涂布，放置在35℃或28℃培養箱中培養72 h。將有生長的菌種分別標記，并在牛肉膏蛋白胨培養基或PDA培養基（含有1 g· L-1的對甲苯磺酸）上劃線純化。純化好的菌種，分別接于50 mL無糖無機鹽培養基（含有5 g·L-1的對甲苯磺酸）中，放置在35℃或28℃恒溫搖床中，130 r/min，初篩培養48 h。初篩了的菌種再次轉接到50 mL無糖無機鹽培養基（含有5 g·L-1的對甲苯磺酸）中，放置在35℃或28℃恒溫搖床中，130 r/min，馴化培養48 h，得到對甲苯磺酸的耐受菌。選取對甲苯磺酸為單一碳源時的生長最好的菌種，挑取單菌落，反復劃線純化得到純菌種，即對甲苯磺酸降解菌，于4℃冰箱保藏備用。

1.2.2對甲苯磺酸降解菌的觀察及鑒定

篩選得到的對甲苯磺酸降解菌經純化培養，在光學顯微鏡進行形態學觀察，初步判斷降解菌為真菌，采用分子生物學進行鑒定。

1.2.3對甲苯磺酸降解菌的固態發酵

取當年新鮮的水稻秸稈，用粉碎機進行粉碎過篩，篩孔直徑0.5 cm。稱取1000 g水稻秸稈粉于發酵桶中，加3000 mL水和速腐劑，充分攪拌均勻，接種對甲苯磺酸降解菌，使菌種充分與秸稈接觸，于28℃恒溫室中發酵培養8天，得到的發酵基質即為工業廢水處理用的對甲苯磺酸降解菌。發酵培養物直接稱重，加入待處理的供試廢水中進行降解處理。

1.2.4對甲苯磺酸降解菌的降解特性研究

取供試廢水50 mL裝于250 mL錐形瓶中，分別調節一定pH值，添加一定的接菌量，28℃下搖床培養一定時間，計算得到對甲苯磺酸降解率。

1.2.5對甲苯磺酸的檢測

采用外標法用液相色譜儀檢測培養后殘留的對甲苯磺酸濃度，檢測條件為：柱：C-18；流動相為：乙腈：水：磷酸=240：235：0.15；檢測波長為：254 nm；流速=0.8 mL/min。

對甲苯磺酸標準曲線公式：y = 1×106x-1912.7（R2= 0.9915）。

對甲苯磺酸降解率（%）=（初始對甲苯磺酸的量-對甲苯磺酸殘余量）/初始對甲苯磺酸的量× 100%

2　結果與討論

2.1對甲苯磺酸降解菌的篩選及鑒定

經過初篩、復篩后，在對甲苯磺酸為單一碳源時，有1株真菌生長明顯優于其他菌種。將此菌種經純化培養，成為對甲苯磺酸的降解菌，并對其進行形態學觀察（圖1、圖2）和鑒定。

該降解菌在菌落為圓形，菌絲初為白絮狀，后為暗綠色。菌落的局部有色素合成，呈現淡黃色。普通光學顯微鏡觀察表明：菌絲纖細無色，多分枝，縱橫交錯。結合菌落形態和顯微鏡檢結果，根據《真菌鑒定手冊》，發現該降解菌屬于木霉屬。對該降解菌的ITS序列BLAST分析可知，該菌屬于哈茨木霉（Trichoderma harzianum）（菌種登入號：HQ011501.1），我們將其命名為哈茨木霉1228。

圖1　對甲苯磺酸降解菌的菌落形態

圖2　對甲苯磺酸降解菌的顯微鏡觀察

2.2對甲苯磺酸降解菌的降解特性研究

2.2.1體系初始pH對哈茨木霉1228降解對甲苯磺酸的影響

取化工廠工業廢水50 mL裝于250 mL錐形瓶中，分別調節pH值至5、6、7、8，添加25%的接菌量，30℃下搖床處理5 h，測定殘余對甲苯磺酸含量，分別計算得到其降解率。實驗做三組平行實驗。

圖3　pH對對甲苯磺酸降解率的影響

實驗結果（圖3）表明，對甲苯磺酸在酸性或堿性環境中降解率都較低，在pH=7的中性環境中降解率最高，這可能是由于哈茨木霉1228中降解對甲苯磺酸的酶屬于一種中性酶，因此對甲苯磺酸在中性環境中降解率最高。

2.2.2菌種添加量對哈茨木霉1228降解對甲苯磺酸的影響

取供試廢水50 mL裝于250 mL錐形瓶中，調節pH值至7，分別添加5%、10%、15%、20%、25%的接菌量，30℃下搖床培養5 h，計算得到對甲苯磺酸降解率。實驗做三組平行實驗。

當添加量增加時，哈茨木霉1228發酵過程中產生的降解對甲苯磺酸所起作用的酶的量也隨之增加，酶量的增加導致催化效率升高，從而降解率升高。但考慮到實際工業應用成本及操作，菌種添加量不易過大。

2.2.3降解時間對哈茨木霉1228降解對甲苯磺酸的影響

取供試廢水50 mL裝于250 mL錐形瓶中，分別調節pH值至5，添加25%的接菌量，30℃下搖床培養，分別于5 h、6 h、7 h、8 h、9 h取樣檢測，計算得到對甲苯磺酸降解率。實驗做三組平行實驗。

圖4　菌種添加量對降解率的影響

圖5　降解時間對哈茨木霉1228降解對甲苯磺酸的影響

酶降解底物受反應時間的影響，隨著反應時間的增加，對甲苯磺酸降解率隨之增加，當反應時間到達7 h降解率最高。但7 h后延長降解時間，對甲苯磺酸的降解率沒有明顯提高。因此，供試廢水的處理時間為7 h。

2.2.4Cu2+添加量對降解率的影響

取化工廠工業廢水50 mL裝于250 mL錐形瓶中，調節pH值至5，添加25%的接菌量，分別添加0.2‰、0.4‰、0.6‰、0.8‰、1‰的Cu2+溶液，30℃下搖床處理5 h，測定殘余對甲苯磺酸含量，分別計算得到其降解率。實驗做三組平行實驗。

實驗發現：隨著Cu2+濃度增加，對甲苯磺酸的降解率明顯增加，當Cu2+濃度為1‰的時候，對甲苯磺酸的降解率比同等條件下不添加Cu2+降解率提高了60%。這說明Cu2+對哈茨木霉1228降解對甲苯磺酸的酶有明顯的促進作用。

圖6　Cu2+添加量對對甲苯磺酸降解的影響

3　結論

目前，化工企業的廢水處理多是先經過復雜的物理化學處理，再進行微生物處理，耗時耗力。本實驗將化工廠未經任何處理的一次廢水，首先經過微生物處理，將主要有毒有害物質大部分清除，再經過一定處理即可以達到廢水的排放標準，而且本實驗處理時間短（7 h）。這為化工企業廢水處理提供了新的思路，對治理化工廢水起到了十分重要的現實意義。

本研究篩選的哈茨木霉1288，在pH=7時添加量為25%，溫度30℃，降解7 h，對甲苯磺酸降解率達到45%。本研究對廢水處理效果較明顯，如經進一步優化處理，降解率可進一步提升。

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材料化學

Isolation and Degradation Characteristics of a New p-Toluenesulfonic Acid Degrading Strains from Chemical Plant Wastewater

SHEN Jie，LI Jia-you，LU Zhu-feng，CAI Li-ling
（College of Biological and Chemical Engineering，Jiaxing University，Jiaxing，Zhejiang 314001，China）

Abstract:The p-toluenesulfonic acid（p-TSA）degrading strain was isoloated from chemical plant wastewater，which can use p-TSA as the sole carbon nutrition for growth．The degrading strain was identified as Trichoderma harzianum based on the results of morphological observation and molecular biological analysis，and it was named Trichoderma harzianum 1228. Trichoderma harzianum 1228 was preparation for treatment of wastewater from chemical plant by solid state fermentation method. The results showed that，the degradation rate of p-TSA can reach 45% when the chemical plant was treated with 5 h at pH=5 and 30℃.

Keywords:p-toluenesulfonic acid（p-TSA）; biological degradation; Trichoderma harzianum; degradation characteristics

作者簡介：沈潔（1978-），女，吉林市人，實驗師，主要研究生物發酵及其相關研究。E-mail：41615491@qq.com。

基金項目：嘉興市科技計劃項目（2014AY21009）；浙江省芳烴磺酸工程技術研究中心開放基金項目（84214001-6）。

文章編號：1006-4184（2016）3-0034-04

修回日期：2016-01-20