前處理對速溶咖啡中多菌靈高效液相色譜檢測的影響

劉丹丹 何飛飛 王志洪 郝淑美

摘 要：采用3種不同的萃取方法提取純化速溶咖啡中的多菌靈，再利用高效液相色譜進行測定，根據凈化方式的繁簡和相對標準誤差值，確定多菌靈適宜的提取方法。結果表明，超聲提取的結果相對標準誤差最小，可以考慮作為速溶咖啡中多菌靈殘留量檢測的參考方法。

關鍵詞：速溶咖啡；多菌靈；超聲提取；高效液相色譜

中圖分類號 S571.2 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）06-135-02

Influence of Pretreatment Methods for the Determination of Carbendazim Content in Instant Coffee by HPLC

Liu Dandan1 et al.

（1Agricultural College，Yunnan University，Kunming 650091，China）

Abstract：Three different extraction and purification methods were performed to detect carbendazim residues in instant coffee using high performance liquid chromatography. The optimum method was selected according to the methods of extraction and purification and the percentage of relative standard deviation. The results indicated that ultrasonic pretreatment showed higher accuracy and lower relative error，compared with the other two pretreatment methods，and thus could be used as the reference method for the determination of carbendazim residues in instant by HPLC.

Key words：Instant coffee；Carbendazim；Ultrasonic pretreatment；HPLC

咖啡作為一種深受人們喜愛的飲品，對其需求量日益劇增。據有關數據統計，我國咖啡消費者的數量越來越大，其安全問題也逐漸成為公眾關注的焦點。咖啡中的農業殘留主要是由于種植過程中使用或環境中攝入的，常用的殺蟲及殺菌劑有六六六、滴滴涕、樂果、百菌清、多菌靈、甲基托布津等[1]。隨著農藥的使用越來越多，環境中的農藥殘留也日益嚴重，已成為影響食品安全的瓶頸。這些農藥的種類繁多，性質各異，在食品中的殘留量極低，傳統的分析方法難以保證其檢測精度。目前，測定農藥殘留主要采用離子-氣象色譜-質譜聯用的方法[2]，但其測定費用較高且針對性較差。隨著現代檢測技術的進步，開發高效準確的農藥殘留檢測方法，以及嚴格的農藥限量標準尤其重要。目前，對于咖啡的農藥殘留檢測均局限于對咖啡豆的檢測[3]，還沒有關于速溶咖啡檢測的報道。農業部NY/T289—1995在標準中只是規定了六六六、滴滴涕2種農藥的殘留量及測定方法[4]。

多菌靈為內吸性光譜殺菌劑，對熱穩定，對酸、堿不穩定，該農藥一旦被植物吸收到體內即產生藥效，是一種常見的殺菌劑。目前對于多菌靈農藥殘留的測定方法在黃瓜及茶葉中在咖啡豆中均有報道[1，4]，檢測方法多為氣相色譜法、高效液相色譜-質譜聯用法、毛細管電泳法等[2，5-7]。其中，質譜連用方法靈敏度高，但是價格昂貴，運行成本較高。因此，建立一種快速、高效、易推廣的檢測方法具有一定的現實意義。為此，本文通過加標回收使用3種不同的方法對速溶咖啡中的多菌靈進行提純凈化，通過比較探討多菌靈最適宜的測定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 儀器：高效液相色譜儀（Waters，e2695），配2489型紫外可見檢測器，超聲波振蕩儀器，旋轉蒸發儀。標準品：多菌靈99.5%（購自國家標準物質中心）。試劑：甲醇、乙酸、鹽酸、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、檸檬酸氫二鈉、乙腈、氯化鈉、無水硫酸鈉、N-丙基乙二胺鍵合固相吸附劑，以上均購自阿拉丁試劑公司，色譜純。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的配置 準確稱取適量的多菌靈標準品，先用少量的鹽酸溶液微熱溶解，再用該鹽酸溶液定容，配成濃度為1.00mg/mL的標準儲備溶液。

1.2.2 色譜條件 檢測器：紫外檢測器；檢測波長：282nm；色譜柱：Waters SunFire C18（5μm，4.6×150mm）；流動相：A：甲醇（含2%乙酸）；B：水；0min，20%A80%B；1min，25%A75%B；12min，45%A55%B；13min，90%A 10%B；15min，20%A80%B；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；進樣量10μL。

1.2.3 樣品前處理 本試驗采用濃度為4.0mg/L多菌靈的農藥處理速溶咖啡樣品，采用3種不同的方法提取凈化多菌靈進行液相色譜法測定，以便篩選最佳前處理方法。

1.2.3.1 處理1 （1）稱取1g咖啡粉，用37μm（相當于400目）篩選，加入25.0mL乙腈，高速混勻2min。（2）加入15g無水硫酸鎂，劇烈振搖1min，2 500r/min離心5min，靜置30min分層。（3）取1.0mL乙腈于2mL離心管中，加入200mg無水硫酸鎂和50mg PSA（N-丙基乙二胺），2 500r/min離心5min。（4）準確吸取0.5mL乙腈溶液，加入0.5mL離子對試劑，振蕩后過0.45μm濾膜，待測。

1.2.3.2 處理2 （1）取稱取1g樣品，用37μm（相當于400目）篩選，放入250mL具塞三角瓶中。（2）加入100mL丙酮/水（50/50，v/v）提取液。浸泡0.5h后振蕩提取1h。抽濾，量取濾液轉入250mL分液漏斗中。（3）加入20mL飽和氯化鈉溶液、50mL二氯甲烷。振蕩萃取1min，靜置分層，下層有機相過無水硫酸鈉，水相再用二氯甲烷50mL萃取2次，合并3次萃取液，用旋轉蒸發器（水浴溫度40℃）濃縮，甲醇定容至1mL，待測。

1.2.3.3 處理3 （1）稱取1g咖啡粉，用37μm（相當于400目）篩選，置于100mL具塞三角瓶中。（2）加入40mL甲醇，超聲波（280W）振蕩10min；然后在振蕩器100r/min振蕩30min提取。（3）加入1mol鹽酸4mL，10g/L氯化鈉40mL，混勻后加入40mL二氯甲烷。（4）水相用2mol氨水中和至pH值為7.5～8，返回分液漏斗中，加入40mL二氯甲烷，劇烈振蕩，靜置分層。（5）有機相過無水硫酸鈉柱至平底燒瓶中，水相中再加入二氯甲烷40mL，重復操作，二氯甲烷分2次從水溶液中提取多菌靈，合并有機相，40℃進行減壓蒸餾。（6）殘渣先用2mL甲醇溶解，移入10mL容量瓶中，清洗2次，定容，過0.45μm微孔濾膜后于液相色譜測定，每個樣品重復3次。

2 結果與分析

從圖1可以看出，多菌靈標準品的出峰時間為14.488min，峰圖對稱性好，沒有出現拖尾現象。以樣品濃度x（mg/L）對峰面積y求出回歸方程并繪制標準曲線。多菌靈標準曲線方程為：y=33427x+410.7；相關系數r2=0.999。

用標準品處理的咖啡樣品中多菌靈的含量，結果如表1。由表1可知，處理3（超聲提取凈化法）純化得到的多菌靈的含量為4.58mg/L，與加入標準品的濃度最接近，相對標準偏差（RSD）和相對誤差均較小，說明該方法測定得到的結果最準確；處理1和處理2提取純化多菌靈的方法雖簡單，但測定的含量偏低，結果不穩定，并且回收率均偏低，這2種方法還需改進。處理3由于經過多次純化，測定方法準確，精密度較高，可以作為測定多菌靈的推薦方法。

參考文獻

[1]中華人民共和國衛生部標準.黃瓜中百菌清殘留量的測定[S].北京：中國標準出版社，2004.（GB/T 5009.105-2003）.

[2]王登飛，陳練洪，游俊，等.固相萃取-HPLC法同時測定果蔬中多菌靈和噻菌靈殘留量[J].農藥，2008，47（6）：443-447.

[3]劉春華，樂淵，陽辛風，等.超高效液相色譜一串聯質譜法快速測定[J].廣東農業科學，2012，24：108-110.

[4]中華人民共和國農業部.小粒種咖啡病蟲害防治技術規程（NY/T1698-2009）[S].

[5]薛思佳，賀紅武，王濤，等.新穎除草劑研究進展[J].化學世界，2002，11（11）：608-614.

[6]饒欽雄，曲明清，趙曉燕，等.HPLC法測定常見蔬菜水果中多菌靈、噻菌靈和苯菌靈殘留量[J].上海農業學報，2009，25（4）：85-88.

[7]王學貴，張琴，徐漢虹，等.高效液相色譜測定茶葉中多菌靈的殘留[J].農藥，2009，48（1）：55-57.

（責編：張宏民）