天麻共生萌發菌栽培種生產工藝條件優化

程立君++段相程++胡志芳++李世輝++趙艷娟++師睿

摘 要：經試驗對天麻共生萌發菌MY-001的栽培種生產的工藝條件進行了優化，結果顯示，既能降低生產成本又能提高生產效率的液體發酵條件為：液體菌種培養器的氣壓為0.020MPa，發酵液主要成分中紅糖、麥麩和蛋白胨的最佳比例為紅糖10g/L、麥麩15g/L、蛋白胨1g/L，萌發菌菌絲生物量隨時間的變化符合邏輯斯蒂增長模型，其觀測值與邏輯斯蒂方程擬合值的擬合度較高（R2=97.7%），發酵培養144h后生物量趨于穩定，栽培種基質最合適的比例為殼斗科植物樹葉60%、闊葉樹木屑30%和麥麩10%。

關鍵詞：天麻；萌發菌；液體發酵；工藝優化

中圖分類號 S567 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）06-17-03

Optimizing the Gastrodia elata Seed-germinating Strains Production Process

Cheng Lijun1 et al.

（1College of Chemistry and Life Sciences，Zhaotong University，Zhaotong 657000，China）

Abstract：The best production process conditions for Gastrodia elata seed-germinating strain MY-001 were optimized. The results showed that the best liquid fermentation conditions were pressure of 0.020MPa，ermented liquid of brown sugar 10g/L，wheat bran 15g/L，peptone 1g/L. The number increasing ofhypha biomass over time accords with the Logisticgrowth model，the observations fit with the logistic equation fitting thehigher value（R2=97.7%），biomass tends to be stable after fermentation 144h. The optimum cultivation of the substrate were determined fagaceae plant leaves60%，broadleaf sawdust 30%，and wheat bran 10%.

Key words：Gastrodia elata；Germinating strain；Liquid fermentation；Process optimization

天麻（Gastrodia elata Blume）為名貴的傳統中藥，云南省昭通市是我國公認的天麻道地藥材產地，特別是昭通市彝良縣小草壩所產的天麻，以優良的品質而馳名中外[1]。天麻屬蘭科多年生草本植物，無根、無綠色葉片，不能進行光合作用營自養生活，其種子發芽必需依靠小菇屬（Mycena）一類萌發菌侵染后才能正常發芽[2-5]。筆者前期對昭通小草壩分離的萌發菌進行了篩選和萌發對比實驗，并將篩選出的菌株在昭通實施了推廣[3]。隨著天麻產業的發展，為加快萌發菌的擴繁，降低生產成本，同時為深入開發利用萌發菌奠定基礎，有必要對萌發菌的深層發酵條件進行研究。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 供試萌發菌菌株為MY-001由昭通學院提供；供試藥品磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉等均為化學純。液體發酵設備使用遼寧全禾生物科技有限公司生產的CQY-130型液體菌種培養器。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌絲生物量測定方法 將培養基配置（馬鈴薯200g、葡萄糖15g、紅糖10g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂1g、泡敵0.3mL、維生素B1 0.005g）后裝入培養器中，124℃滅菌30min，冷卻至25℃后接種1L液體母種，根據實驗要求設計的條件培養完成后，接出1L培養液，搖至菌球在培養液中均勻分布時量取100mL，抽濾、干燥稱取菌絲體的重量，每處理設3個重復。

1.2.2 氣壓對萌發菌MY-001菌絲生長的影響 分別設置液體菌種培養器內的氣壓為0.020MPa、0.035MPa、和0.050MPa，參照1.2.1的方法，培養120h后，觀察菌球的形態，稱取菌絲體的重量，每處理設3個重復。

1.2.3 發酵液成分及比例對萌發菌MY-001菌絲生長的影響 根據前期的研究成果，以1L培養基馬鈴薯100g、葡萄糖15g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂1g、泡敵0.3mL、維生素B 0.005g為基礎，分別添加紅糖0、10g、20g，麥麩10g、15g、20g、25g及蛋白胨0、1g、2g，參照1.2.1的方法，培養120h后，稱量菌絲體的生物量，每處理設3個重復。

1.2.4 萌發菌MY-001菌絲生物量生長曲線 在以上篩選獲得的菌絲最佳條件下培養，48h后每隔12h參照1.2.1的方法，稱取菌絲體的重量，以培養時間為橫坐標，菌絲體生物量為縱坐標繪制生長曲線。數據分析用軟件SPSS13.0進行。

1.2.5 栽培種基質比例對萌發菌MY-001菌絲生長速度的影響 萌發菌栽培種培養基質主要由殼斗科植物樹葉、闊葉樹木屑及麥麩混合組成，為節省生產成本同時方便野外種植時的使用，以殼斗科植物樹葉含量60%為基礎，參照表1中的比例調整木屑和麥麩。在17cm×33cm的聚丙烯食用菌袋中裝入定量的培養基質，滅菌冷卻后，每袋接種20mL液體菌種，25℃培養7d后用記號筆在聚丙烯食用菌袋上劃出菌絲的生長線，并以此為基線，一個月后記錄菌絲生長速度和菌落生長特征，每處理設5個重復。

表1 培養基質中樹葉、木屑和麥麩比例（%）

[序號＼&樹葉＼&木屑＼&麥麩＼&1#＼&60＼&20＼&20＼&2#＼&60＼&25＼&15＼&3#＼&60＼&30＼&10＼&4#＼&60＼&35＼&5＼&5#＼&60＼&40＼&0＼&]

2 結果與分析

2.1 氣壓對萌發菌MY-001菌絲生長的影響 液體菌種培養器的氣壓對萌發菌MY-001菌絲生物量的影響見表2。表2顯示，氣壓對菌絲生物量具有顯著影響，在低氣壓狀態時菌球生長狀況較好，具有明顯的毛刺，靜止后懸浮于培養液中，當氣壓在0.020～0.035MPa時菌絲生物量之間不存在顯著差異，氣壓在0.020MPa時達到（0.53±0.03g）。

表2 氣壓對菌絲生長的影響

[培養器內氣壓（MPa）＼&菌絲生物量

（g）＼&菌球生長形態＼&0.020＼&0.53±0.03A＼&菌球形態正常，具有明顯的毛刺，靜止后懸浮于培養液中，少量菌絲分散而不成球狀。＼&0.035＼&0.50±0.02AB＼&菌球形態均勻，具有明顯的毛刺，但分散菌絲較多。＼&0.050＼&0.49±0.03B＼&菌絲易老化，大量菌絲分散浮于發酵液表層。＼&]

注：菌絲生物量由平均值±標準誤差（SE）表示；不同大寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

2.2 發酵液成分及比例對萌發菌MY-001菌絲生物量的影響 發酵液主要成分紅糖、麥麩和蛋白胨對萌發菌MY-001菌絲生物量的影響見表3。由表3可知，在液體菌種培養器中隨著紅糖、麥麩和蛋白胨的增加菌絲生物量也在增加，但為降低生產成本又不影響生長效果，最佳比例為紅糖10g/L、麥麩15g/L、蛋白胨1g/L。

表3 發酵液成分及比例對萌發菌MY-001菌絲生物量的影響

[紅糖

（g/L）＼&菌絲生物量

（g）＼&麥麩

（g/L）＼&菌絲生物量

（g）＼&蛋白胨

（g/L）＼&菌絲體重量

（g）＼&0＼&0.45±0.03A＼&10＼&0.56±0.03A＼&0＼&0.63±0.01A＼&10＼&0.53±0.04B＼&15＼&0.59±0.02AB＼&1＼&0.72±0.03B＼&20＼&0.55±0.03B＼&20＼&0.63±0.02B＼&2＼&0.74±0.02B＼&＼&＼&25＼&0.65±0.03B＼&＼&＼&]

注：菌絲生物量由平均值±標準誤差（SE）表示；不同大寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

2.3 萌發菌MY-001菌絲生物量生長曲線 由圖1可知，萌發菌菌絲生物量生長隨時間的變化呈“S”型增長，84h以前為增長延遲期，84～144h為對數增長期，144h以后進入穩定期。因此，在萌發菌發酵工藝生產過程中，在發酵培養144h即可獲得較高的生物量。采用SPSS13.0進行分析，平均生物量（Y）與發酵時間（X）的關系符合邏輯斯蒂曲線模型（F=426.203，P=0.000<0.01），數學模型為

Y=[10.87+126.75×0.951x]，產孢量的實際觀測值與數學模擬值能夠較好的重合（圖1），模型確定系數R2達97.7%，所獲得的參數能通過t檢驗（t=3.418，P=0.007<0.01）。

<＼＼Pc10＼工作盤 （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農學通報雜志＼2016-6農學通報內文＼s84-1.eps>

圖1 菌絲生物量觀測值與邏輯斯蒂方程擬合值的比較

2.4 栽培種基質比例對萌發菌MY-001菌絲生長速度的影響 栽培種基質的不同比例對萌發菌MY-001菌絲生長速度的影響見表4。表4顯示，基質主要成分殼斗科植物樹葉、闊葉樹木屑和麥麩各占60%、25%和15%時菌絲生長速度最快，達（0.52±0.02）cm/d，但考慮到降低生產成本又不顯著影響菌絲生長效果，當殼斗科植物樹葉、闊葉樹木屑和麥麩各占60%、30%和10%時，菌絲日均生長速度為（0.48±0.05）cm/d，與1#相比不存在顯著差異，但成本較低。

表4 栽培種基質比例對萌發菌MY-001菌絲生長速度的影響

[序號＼& 基質成分比例（%） ＼&菌絲日均生長速度

（cm/d）＼&差異顯著性＼&樹葉＼&木屑＼&麥麩＼&1#＼&60＼&20＼&20＼&0.51±0.04＼&A＼&2#＼&60＼&25＼&15＼&0.52±0.02＼&A＼&]

（下轉176頁）

（上接18頁）

[序號＼& 基質成分比例（%） ＼&菌絲日均生長速度

（cm/d）＼&差異顯著性＼&樹葉＼&木屑＼&麥麩＼&3#＼&60＼&30＼&10＼&0.48±0.05＼&AB＼&4#＼&60＼&35＼&5＼&0.43±0.03＼&B＼&5#＼&60＼&40＼&0＼&0.33±0.05＼&B＼&]

注：菌絲生物量由平均值±標準誤差（SE）表示；不同大寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

3 討論與結論

目前在各天麻產區菌種的需求量日益擴大，隨著生物發酵工程技術的發展，由于液體發酵具有生產成本低、時間短、生產快、污染少等特點，將取代傳統、樸素的固體制種技術成為趨勢[6]。本研究通過對天麻共生萌發菌MY-001的深層發酵條件工藝的優化，篩選合適的發酵條件對產業的發展具有重要意義。研究結果顯示，既能降低生產成本又能提高生產效率的液體發酵條件為：液體菌種培養器的氣壓為0.020MPa；發酵液主要成分紅糖、麥麩和蛋白胨最佳比例為紅糖10g/L、麥麩15g/L、蛋白胨1g/L；萌發菌菌絲生物量隨時間的變化符合邏輯斯蒂增長模型，其觀測值與邏輯斯蒂方程擬合值的擬合度較高（R2=97.7%），發酵培養144h后生物量趨于穩定；栽培種基質中使用殼斗科植物樹葉的天麻種子萌發效果較好，能促進種子的萌發[2]，因此選用殼斗科植物的樹葉作為主要成分，經篩選最合適的比例為殼斗科植物樹葉60%、闊葉樹木屑30%和麥麩10%。

參考文獻

[1]李德勛，張觀敏，馬躍新.昭通天麻的原植物調查與鑒定[J].現代中藥研究與實踐，2005，19（1）：29-31.

[2]徐錦堂.中國天麻栽培學[M].北京：北京醫科大學中國協和醫科大學聯合出版社，1993：1-99.

[3]楊世林，蘭進，徐錦堂.天麻的研究進展[J].中草藥，2000，3（1）：66-69.

[4]徐錦堂，郭順星，范黎，等.天麻種子與小菇屬真菌共生萌發的研究[J].菌物系統，2001，20（1）：137-141.

[5]郭順星，王秋穎.促進天麻種子萌發的石斛小菇優良菌株特性及作用[J].菌物系統，2001，20（3）：408-412.

[6]林靜，趙萍，何莉莉，等.食用菌液體菌種培養器的設計[J].農機化研究，2007（9）：105-108. （責編：張宏民）