二甲雙胍對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞Twist及E-cadherin表達(dá)的影響及機(jī)制

湯軼，孫曉紅

(南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院，湖南衡陽(yáng)421000)

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二甲雙胍對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞Twist及E-cadherin表達(dá)的影響及機(jī)制

湯軼，孫曉紅

(南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院，湖南衡陽(yáng)421000)

摘要：目的觀察二甲雙胍處理后宮頸癌Hela細(xì)胞JAK/STAT3信號(hào)通路調(diào)節(jié)靶基因Twist及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)變化，并探討其機(jī)制。方法 宮頸癌Hela細(xì)胞培養(yǎng)后分別經(jīng)IL-6(IL-6組)、二甲雙胍(二甲雙胍組)及IL-6+二甲雙胍(IL-6+二甲雙胍組)處理48 h，未處理細(xì)胞作對(duì)照組，觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，檢測(cè)細(xì)胞壞死情況，Western blotting法檢測(cè)p-STAT3、Twist及E-cadherin蛋白表達(dá)，RT-PCR法檢測(cè)Twist、E-cadherin mRNA表達(dá)。結(jié)果IL-6組Hela細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，而IL-6+二甲雙胍組Hela細(xì)胞未向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變且細(xì)胞壞死。IL-6組、IL-6+二甲雙胍組p-STAT3、Twist、E-cadherin蛋白表達(dá)及Twist、E-cadherin mRNA表達(dá)與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，而二甲雙胍組以上指標(biāo)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論 二甲雙胍可通過(guò)阻斷JAK/STAT3信號(hào)通路降低宮頸癌Hela細(xì)胞Twist及E-cadherin的表達(dá)。

關(guān)鍵詞：宮頸腫瘤；二甲雙胍；白細(xì)胞介素6；JAK/STAT3信號(hào)通路；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

在腫瘤細(xì)胞中，多種因素可持續(xù)激活JAK/STAT3信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。細(xì)胞因子如IL-6，通過(guò)激活STAT3，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫系統(tǒng)的侵襲作用[1~3]。腫瘤細(xì)胞EMT特征性表現(xiàn)是E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)缺失，最終使細(xì)胞黏附能力下降，侵襲和遷移能力增強(qiáng)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍具有抗腫瘤作用及降低腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，并能提高腫瘤患者的存活率[4~8]。但是，二甲雙胍的抗腫瘤機(jī)制尚不完全清楚。2014年1~10月，本研究觀察二甲雙胍對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞Twist及E-cadherin表達(dá)的影響，并探討其機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料RPMI1640(Hyclone)，胎牛血清(四季青公司)，胰蛋白酶、RIPA裂解液(碧云天公司)，人IL-6(Peprotech)，二甲雙胍(Sigma)，死活細(xì)胞染色試劑盒(凱基)；單克隆抗體Twist、E-cadherin、p-stat3(Abcam)，RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR反應(yīng)試劑盒(Qiagen)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma)；倒置顯微鏡 IX71、熒光顯微鏡(Olympus)；生物安全柜(Thermo Scientific)；逆轉(zhuǎn)錄及PCR儀(Bio-Rad)。

1.2Hela細(xì)胞培養(yǎng)Hela細(xì)胞由南華大學(xué)腫瘤研究所提供，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿6孔板后，分別采用含50 ng/mL IL-6(IL-6組)、10 mmol/L二甲雙胍(二甲雙胍組)培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，先用含50 ng/mL IL-6的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，再用含10 mmol/L二甲雙胍(IL-6+二甲雙胍組)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，對(duì)照組則采用單純培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.3細(xì)胞染色各組細(xì)胞處理48 h，按死活細(xì)胞染色試劑盒要求進(jìn)行染色，活細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，壞死細(xì)胞呈現(xiàn)橙色熒光，熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞染色情況。

1.4細(xì)胞p-STAT3、Twist及E-cadherin蛋白表達(dá)檢測(cè)采用Western blotting法。各組細(xì)胞處理48 h，提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，上樣，跑膠，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育，洗膜，二抗孵育，顯色，成像。用Image Lab軟件測(cè)量目標(biāo)蛋白條帶的灰度值，與內(nèi)參的灰度值進(jìn)行比較，取對(duì)比值作為目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。

1.5細(xì)胞Twist、E-cadherin mRNA表達(dá)檢測(cè)采用RT-PCR法。各組細(xì)胞處理48 h，按照試劑盒要求提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并按以下條件進(jìn)行PCR：95℃ 5 min, 95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。其中GAPDH為內(nèi)參基因， Twist引物序列F：5′-CGTTTCCAGGAGGCCTGGCG-3、R：5′-GCGAGA-CTGGCGAGCTGGAC-3；E-cadherin引物序列F：5′-GGGTTATTCCTCCCATCAGC-3、R：5′- ATTCGGGCTTGTTGTCATTC-3；GAPDH引物序列F：5′-CTTCTA-CAATGAGCTGCGTG-3,R：5′-TCATGAGGTAGTCAGT-CAGG-3。以2-ΔΔCt公式計(jì)算Twist、E-cadherin mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化Hela細(xì)胞經(jīng)處理48 h，對(duì)照組細(xì)胞橢圓形，緊密排列；IL-6組細(xì)胞間隙明顯增寬，細(xì)胞呈紡錘狀和長(zhǎng)梭形，排列散亂，可見Hela細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變；二甲雙胍組細(xì)胞形態(tài)圓形，細(xì)胞成團(tuán)堆積，較多凋亡細(xì)胞漂?。籌L-6+二甲雙胍組細(xì)胞形態(tài)圓形、長(zhǎng)梭形，細(xì)胞核疏松，細(xì)胞成團(tuán)漂浮。

2.2各組細(xì)胞染色結(jié)果Hela細(xì)胞經(jīng)處理48 h，對(duì)照組、IL-6組只有少量細(xì)胞壞死，二甲雙胍組有較多細(xì)胞壞死，而IL-6+二甲雙胍組全為壞死細(xì)胞(細(xì)胞成片漂浮)。

2.3各組細(xì)胞p-STAT3、Twist及E-cadherin蛋白表達(dá)比較見表1。

表1　各組細(xì)胞p-STAT3、Twist及E-cadherin蛋白

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.4各組細(xì)胞Twist、E-cadherin mRNA表達(dá)比較見表2。

表2　各組細(xì)胞Twist、E-cadherin mRNA

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3討論

在腫瘤細(xì)胞中，細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、炎癥因子等通過(guò)改變腫瘤微環(huán)境，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化。腫瘤微環(huán)境中重要的炎癥因子，能通過(guò)與相應(yīng)受體特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過(guò)持續(xù)激活JAK/STAT3信號(hào)通路調(diào)節(jié)靶基因Twist及EMT相關(guān)標(biāo)志物蛋白如E-cadherin表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞向間質(zhì)表型改變，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移[1~3]。本研究發(fā)現(xiàn)，用重組人IL-6處理宮頸癌Hela細(xì)胞，出現(xiàn)細(xì)胞間隙增寬，呈紡錘狀或長(zhǎng)梭形，細(xì)胞核顏色變深，誘導(dǎo)Hela細(xì)胞向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)變。在蛋白及基因表達(dá)水平，我們發(fā)現(xiàn)，用IL-6處理Hela細(xì)胞后，STAT3磷酸化水平升高，并使相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Twist蛋白及基因表達(dá)上調(diào)，EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白E-cadherin蛋白及基因表達(dá)下調(diào)，與相關(guān)研究[9]結(jié)果一致。

二甲雙胍是臨床廣泛應(yīng)用的抗2型糖尿病藥物。有研究報(bào)道，二甲雙胍能通過(guò)阻斷JAK/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及自噬相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)與肝腫瘤細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)而逆轉(zhuǎn)EMT，抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，最終抑制腫瘤進(jìn)展[3，10]。在肝癌細(xì)胞中，二甲雙胍和蛋白激酶(AMPK)激活劑都能抑制IL-6誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，并且能通過(guò)腺苷-磷酸激活A(yù)MPK途徑調(diào)節(jié)IL-6/gp130/JAK/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)促炎癥因子的表達(dá)[11~13]。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-6+二甲雙胍組宮頸癌Hela細(xì)胞形態(tài)由狹長(zhǎng)變圓，細(xì)胞核松散，出現(xiàn)核碎裂，壞死細(xì)胞大量漂浮，比單獨(dú)使用二甲雙胍對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用更顯著?？梢姡瑔为?dú)使用二甲雙胍處理Hela細(xì)胞，不能明顯降低STAT3磷酸化水平、Twist蛋白及Twist mRNA表達(dá)、上調(diào)E-cadherin蛋白及mRNA表達(dá)。IL-6處理Hela細(xì)胞后加入二甲雙胍，使STAT3磷酸化水平降低、Twist蛋白及mRNA表達(dá)降低，逆轉(zhuǎn)Hela細(xì)胞EMT，與文獻(xiàn)報(bào)道一致；但是E-cadherin蛋白及mRNA表達(dá)較對(duì)照組不升反降，與文獻(xiàn)研究結(jié)果相反。我們分析，用IL-6、二甲雙胍聯(lián)合處理宮頸癌Hela細(xì)胞，通過(guò)抑制JAK/STAT3信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞壞死，導(dǎo)致總體細(xì)胞量減少，使細(xì)胞總蛋白及總mRNA減少，最終導(dǎo)致E-cadherin蛋白及mRNA表達(dá)降低。以上研究結(jié)果證明，二甲雙胍以JAK/STAT3信號(hào)通路為靶點(diǎn)，阻斷JAK/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制宮頸癌細(xì)胞EMT。

綜上所述， IL-6能促進(jìn)Hela細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，而二甲雙胍可通過(guò)JAK/STAT3信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)宮頸癌Hela細(xì)胞EMT，為臨床二甲雙胍治療宮頸癌提供了新思路，但其具體機(jī)制及可行性還有待進(jìn)一步研究證明。

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(收稿日期：2015-10-11)

中圖分類號(hào)：R737.33

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)09-0031-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.09.011

通信作者：孫曉紅(E-mail:csxtt@sina.com)