補陽還五湯提取物灌胃對腦出血大鼠腦組織中PI3K、AKT、Caspase-3表達的影響

仇志富，吳曉光，孟杰，祖炳學，李蒙蒙，苗惠，時召平

(1承德醫學院，河北承德067000；2承德醫學院河北省中醫藥抗癡呆重點研究室；3承德醫學院附屬醫院；4撫寧縣第二人民醫院；5承德市中醫院)

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補陽還五湯提取物灌胃對腦出血大鼠腦組織中PI3K、AKT、Caspase-3表達的影響

仇志富1，吳曉光2，孟杰3，祖炳學4，李蒙蒙1，苗惠1，時召平5

(1承德醫學院，河北承德067000；2承德醫學院河北省中醫藥抗癡呆重點研究室；3承德醫學院附屬醫院；4撫寧縣第二人民醫院；5承德市中醫院)

摘要：目的觀察補陽還五湯提取物對腦出血大鼠腦組織磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、絲/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)表達的影響，探討其對腦組織的保護作用機制。方法 將72只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、補陽還五湯組、銀杏葉片組各18只，后4組采用Rosenberg法建立腦出血大鼠模型后，分別給予生理鹽水、補陽還五湯提取物、銀杏葉片連續灌胃35 d。用免疫組化法檢測PI3K、AKT、Caspase-3蛋白表達，TUNEL法檢測腦組織細胞凋亡情況，干濕重法檢測腦組織含水量，甲酰胺法檢測血-腦脊液屏障通透性。結果與模型組比較，補陽還五湯組、銀杏葉片組PI3K、AKT蛋白表達水平升高，Caspase-3蛋白表達水平降低，腦組織含水量、凋亡細胞數減少，血-腦脊液屏障通透性降低(P均<0.05)。結論 補陽還五湯提取物可能通過激活PI3K/AKT信號通路，降低血-腦脊液屏障通透性來保護腦出血大鼠腦組織。

關鍵詞：腦出血；補陽還五湯；磷脂酰肌醇3激酶/絲/蘇氨酸蛋白激酶信號通路；半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3;大鼠

腦出血后發生細胞凋亡的機制復雜多樣，細胞凋亡過程涉及的信號轉導通路中，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/絲/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)信號轉導通路極為重要，其可通過調控凋亡蛋白和凋亡基因來抑制細胞凋亡[1]。補陽還五湯可用于治療缺血性、出血性腦病，能通過減少神經元死亡、促進神經修復再生等機制來發揮作用。補陽還五湯能夠激活數條與細胞凋亡聯系密切的信號轉導通路[2]，然而其對PI3K/AKT信號轉導通路的影響卻鮮見報道。2014年12月~2015年7月，本研究觀察補陽還五湯對腦出血大鼠腦組織的保護作用，并探討其作用機制。

1材料與方法

1.1動物及試劑成年雄性清潔級SD大鼠72只，體質量(250±20)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。中藥(補陽還五湯組成：生黃芪120 g、當歸尾6 g、赤芍4.5 g、川芎4.5 g、干地龍3 g、桃仁3 g、紅花3 g)購自承德大藥房，銀杏葉片購自雙鶴藥業有限公司。補陽還五湯通過水煎醇沉法制備濃度為5.0 g/mL的提取物備用，4 ℃冰箱保存；銀杏葉片研磨成細粉以雙蒸水送服。PI3K、AKT兔抗大鼠多克隆免疫組化試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)檢測試劑盒購自上海志研生物科技有限公司；TUNEL凋亡檢測試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司；其他試劑皆為國產分析純。

1.2動物分組與模型制備將大鼠隨機分為4組：假手術組、模型組、補陽還五湯組、銀杏葉片組，各18只。腦出血大鼠模型的制備參考文獻[3]，以10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射，大鼠麻醉后固定于立體儀上，于頭部正中行縱行切口，將大鼠骨膜剝離，使其冠狀縫和前囟裸露。在前囟之前約2.0 mm、中線右側約3.0 mm處鉆一約1.0 mm直徑的小孔。以微量注射器從股動脈抽取適量的血液，借助立體定向儀沿鉆孔垂直進針6.0 mm左右，緩緩注血80 μL，留針10 min后撤針，以消毒針縫合切口。假手術組僅裸露頸總動脈、神經。造模第2天，補陽還五湯組、銀杏葉片組灌胃給藥，藥量分別為26 g/(kg·d)、3.5 mg/(kg·d)，假手術組及模型組給予生理鹽水10 mL/kg，均連續給藥35 d。

1.3腦組織PI3K、AKT、Caspase-3蛋白表達檢測采用免疫組化法。最后1次給藥后12 h，每組隨機選6只大鼠，以乙醚麻醉斷頭處理，選取視交叉至漏斗部之間的腦組織，10%甲醛于4 ℃冰箱固定48 h，石蠟包埋，冠狀切片5 μm厚，常規脫蠟、乙醇浸水，以枸櫞酸鹽緩沖液微波法進行抗原修復，水洗后分別滴加兔抗大鼠PI3K(1∶150)、AKT(1∶100)多抗，于4 ℃下靜置12 h，孵育30 min，DAB顯色后蘇木精復染，常規脫水、透明、封片。PI3K、AKT蛋白相對表達量計算采用MiVnt圖形采集分析系統檢測陽性細胞吸光度值，取平均值，利用PBS作陰性對照。Caspase-3蛋白表達檢測嚴格按照試劑盒說明操作，于酶標儀435 nm波長處檢測吸光度值，Curve Expert 1.0軟件經對照品的標準曲線計算樣品Capase-3蛋白相對表達量。

1.4腦組織凋亡細胞計數取腦組織標本，采用缺口末端標記法(TUNEL法)原位檢測細胞凋亡變化，嚴格按照TUNEL凋亡檢測試劑盒操作說明進行。計數每視野凋亡細胞數量。

1.5腦組織含水量測算各組分別取6只大鼠斷頭、取腦，去除嗅球部分，稱濕重后于90 ℃干燥箱干燥24 h，再稱重。計算腦組織含水量，含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.6血-腦脊液屏障通透性檢測取各組剩余6只大鼠，于尾部靜脈注射2%伊文思藍(EB)，3 h后以水合氯醛麻醉，于大鼠左心室注射0.2 L生理鹽水沖洗血管內血液，取腦稱量，腦組織放于甲酰胺內，于60 ℃下水浴24 h，勻漿后離心(1 000 r/min、6 min)，于酶標儀635 nm波長處檢測上清液吸光度值，計算EB含量。EB含量越高，血-腦脊液屏障通透性越強。

2結果

PI3K、AKT 、Caspase-3蛋白均位于胞質上，陽性表達呈棕黃色物質沉積。各組腦組織中PI3K、AKT、Caspase-3蛋白表達水平及腦組織凋亡細胞數、含水量、血-腦脊液屏障通透性比較見表1。

表1　各組腦組織PI3K、AKT、Caspase-3蛋白表達水平及凋亡細胞數、含水量、EB含量比較±s)

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。 3討論

PI3K/AKT信號轉導通路作為細胞生存的信號通路之一，其在細胞增殖、分化，抑制神經細胞凋亡方面起到了重要的作用[4]。腦出血后，機體本身可以釋放出一些能夠將具有酪氨酸激酶活性受體激活的物質，受體經過其磷酸化以后會特異性地結合PI3K的調節亞基，從而將PI3K激活；PI3K激活后可使細胞膜上的肌醇發生磷酸化，生成第二信使[5，6]。AKT的激活需要依賴Ser473的磷酸化，AKT磷酸化激活后即成為p-AKT。p-AKT通過直接將其下游凋亡靶蛋白磷酸化或者間接改變、編碼凋亡相關蛋白的基因表達來實現腦保護作用。總之，PI3K/AKT信號通路激活后，能夠作用于Bcl-2、Caspase-3為下游凋亡靶蛋白，通過激活或抑制其表達來發揮生物學效應。銀杏葉片治療腦出血療效肯定且安全，其作用已得到學術界公認，常被用作實驗的對照藥物。本研究也以銀杏葉片作為陽性對照藥，結果顯示補陽還五湯與銀杏葉片的作用相當，補陽還五湯能夠更好地將該信號轉導通路激活，發揮腦保護作用。補陽還五湯組大鼠腦組織PI3K、AKT蛋白表達升高，細胞凋亡數量減少，與李峰等[7]研究結果一致，提示補陽還五湯可抑制神經細胞凋亡，該作用與PI3K/AKT信號通路的激活密不可分。

細胞凋亡的最終解釋是Caspase-3激活所致，若Caspase-3表達增強，則細胞凋亡加劇；反之，則可以產生較明顯的神經保護作用[8~11]。作為凋亡信號上游因子的Caspase-3，其表達增強后能夠與其下游凋亡靶基因相互作用，使神經系統受損[12]。腦出血損傷中，有效抑制Caspase-3的激活，能夠減少神經細胞凋亡，對腦出血發揮治療和保護腦組織作用。Caspase-3的表達很大程度上也受到PI3K/AKT信號通路的影響，PI3K/AKT信號通路的激活能夠間接抑制凋亡執行蛋白Caspase-3及其下游凋亡靶基因的級聯反應，起到腦保護作用[13，14]。本研究中補陽還五湯組Caspase-3蛋白表達水平低于模型組，提示補陽還五湯可通過激活PI3K/AKT信號通路調節凋亡調控蛋白Caspase-3表達變化。

血-腦脊液屏障通透性破壞引發的腦水腫對于遲發性神經細胞損傷和凋亡有促進作用，加重細胞功能障礙和壞死[8]。本研究發現，與模型組比較，補陽還五湯組大鼠腦組織血-腦脊液屏通透性降低，腦水腫減輕，可見補陽還五湯發揮了較好的腦保護作用。

綜上所述，補陽還五湯提取物能夠激活PI3K/AKT信號轉導通路，降低大鼠血-腦脊液屏通透性，下調Caspase-3蛋白表達來實現減輕腦水腫、抑制細胞凋亡的生物學效應。然而補陽還五湯提取物激活PI3K/AKT信號通路后是否也能介導其他凋亡因子發生改變尚不明確；同時，信號轉導通路眾多，其是否能夠激活其他重要的通路仍未可知，需進一步研究證實。

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(收稿日期：2015-09-10)

中圖分類號：R743.34

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)09-0029-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.09.010

通信作者：吳曉光(E-mail:ewxg@qq.com)

基金項目：河北省高等學校重點學科病理生理學項目資助(2013)。