強精固腎湯對熱應激雄性大鼠生殖功能的影響

張祁，賀之英，董佳琦，王以東，高俊濤

(吉林醫藥學院，吉林吉林132013)

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強精固腎湯對熱應激雄性大鼠生殖功能的影響

張祁，賀之英，董佳琦，王以東，高俊濤

(吉林醫藥學院，吉林吉林132013)

摘要：目的觀察強精固腎湯對熱應激雄性大鼠生殖功能的保護作用，并探討其可能的作用機制。方法 清潔級Wistar大鼠60只，隨機均分為正常對照組、模型組、硫酸鋅組及強精湯大、中、小劑量組，分別給予生理鹽水、生理鹽水、硫酸鋅及強精固腎湯4 000、2 000、1 000 mg/kg灌胃，連續30 d，除正常對照組外，將其余各組大鼠置于42 ℃高溫環境1 h/d，連續14 d。熱應激第7、14天進行大鼠性行為能力的觀察，包括撲捉潛伏期(CIP)、撲捉次數(CT)、精子相對計數、精子畸形率；檢測血清與睪丸組織中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)。結果與模型組比較，熱應激第7、14天強精湯大、中劑量組大鼠的CIP縮短、CT增加，精子相對計數增加、精子畸形指數降低，血清和睪丸組織中SOD的活性增強、MDA水平降低(P均<0.05)；強精湯大劑量組上述指標與正常對照組比較差異無統計學意義(P均>0.05)。結論 強精固腎湯能夠改善熱應激雄性大鼠的生殖功能，該作用可能與減輕生殖細胞的氧化損傷有關。

關鍵詞：熱應激；強精固腎湯；生殖功能；氧化損傷；大鼠

高溫環境對人類生殖功能危害較大，使男性生殖能力下降，甚至導致不孕不育癥發病率逐年升高[1]。研究表明，高溫引起的熱應激與雄性生殖功能密切相關，可導致精子發育異常[2~4]。目前，對熱應激引起的雄性生殖功能改變尚缺乏特效的治療方法。強精固腎湯是本實驗室自主研發的組方藥，在以往的應用中發現其具有生精強精作用。本研究于2015年4 ~ 10月觀察了強精固腎湯對熱應激大鼠生殖功能的保護作用，并探討其作用機制。

1材料與方法

1.1動物及分組清潔級Wistar大鼠120只(由吉林大學動物實驗中心提供)，雄性，體質量(180±20)g，適應性飼養1周，室溫(22±2)℃，相對濕度40%~60%。將大鼠隨機分為6個小組，即正常對照組、模型組、硫酸鋅組及強精湯大、中、小劑量組各20只。

1.2儀器與試劑 DKB-501S型超級恒溫水浴(上海精宏實驗設備有限公司)，Hitachi 7600生化分析儀(日本Tokyo公司)，多通道生理記錄儀(美國BiopacMP150)；ZMN-7803型全自動組織包埋機(常州市華利電子有限公司)，RM2126型輪轉式切片機(上海徠卡儀器有限公司)，BA300型數碼生物顯微鏡(中國麥克奧迪實業集團有限公司)，酶標儀(SUNRISE)，TD5A 型臺式低速離心機(湖南凱達科學儀器有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒(南京建成生物技術研究所)。硫酸鋅(神威藥業有限公司生產)；強精固腎湯，組成：熟地、首烏、枸杞、山萸肉、補骨脂、淫羊藿、鎖嚴子、菟絲子、仙茅、巴戟、肉蓯蓉、附子、黃芪等，藥物購自吉林國藥制藥有限責任公司，將上述藥物加水煎煮3次，濾汁去渣，合并濾液，加熱濃縮成口服液，每毫升含生藥0.8 g。

1.3大鼠熱應激模型制備硫酸鋅組以硫酸鋅40 mg/kg灌胃，強精湯大、中、小劑量組大鼠分別以強精固腎湯1 000、2 000、4 000 mg/kg灌胃，正常對照組和模型組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃，均連續給藥30 d。除正常對照組外其余各組均接受熱暴露，使用超級恒溫水浴，連接有機玻璃夾層水循環艙，保持室溫為23.0~24.0 ℃，控制水溫，保持熱循環艙實測溫度為42 ℃，相對濕度40%~60%，風速0~0.2 m/s，穩定1 h以上。將大鼠置于大小合適固定器中，放入熱倉，1 h/d，連續14 d。

1.4性行為觀察參照Agmo[5]的方法，在安靜室內,各組于熱應激第7天各取10只大鼠、第14天各取剩余10只大鼠放置于50 cm×35 cm×20 cm干凈籠中適應5 min，隨后投入同批飼養的正常雌性大鼠形成1對1配對，觀察30 min。觀察放置雌性大鼠后，雄性大鼠的第1次撲捉時間，即撲捉潛伏期(CIP)，同時觀察雄性大鼠在30 min內對雌性大鼠的撲捉次數(CT)。

1.5精子相對計數測定于熱應激第7、14天，各組分別取10只大鼠處死，取雙側附睪，在盛有2 mL生理鹽水(37 ℃)的潔凈培養皿中行剝離術，游離附睪中的精子。剝離好的附睪放置37 ℃的恒溫箱中孵育15~20 min，取出過濾(4層濾紙)至EP試管。用移液槍取出100 μL精液，加入3%的NaCl 溶液100 μL固定，輕輕混勻后取適量滴加至紅細胞計數板中，在顯微鏡下計數精子數。計數原則：對于壓線精子只計數精子頭，數上不數下，數左不數右。視精子密度而定，若精子密度高，則取1滴精液涂片即可。涂好的涂片自然風干，待其干燥后，加入適量甲醇固定，待其干燥后，置于2%的伊紅染液中染色1 h，染好后取出經細小流水輕輕沖洗，自然干燥后，于顯微鏡下觀察。在低倍顯微鏡下找到背景清晰精子重疊較少的部位，用高倍顯微鏡順序檢查精子形態，用紅細胞計數板計數1 mL精液中所含的精子數。每只大鼠檢查完整的精子500條，計數其中畸形精子的個數，計算畸形指數。

1.6血清及睪丸組織SOD和MDA檢測分別于熱應激第7、14天大鼠處死前經腹主動脈取血，將血液置于肝素處理過的冰浴試管內，將睪丸組織切碎勻漿，以3 000 g的離心力離心30 min，分別取血清和上清液進行檢測，采用ELISA法檢測SOD和MDA，嚴格按照相應試劑盒說明進行操作。

2結果

2.1強精固腎湯對熱應激雄性大鼠性行為的影響見表1。

2.2強精固腎湯對熱應激雄性大鼠精子的影響見表2。

2.3強精固腎湯對熱應激雄性大鼠血清及睪丸組織SOD、MDA水平的影響見表3、4。

3討論

嚴重的高溫環境，可導致內臟血管收縮、缺血缺氧、內毒素血癥、炎性細胞因子過度產生或釋放并產生過量的氧自由基，最終導致多器官功能障礙[6,7]。熱應激導致微血管內皮細胞損傷，白細胞、血小板及單核巨噬細胞激活，白細胞釋放IL-1β、IL-6等一系列炎性因子[8]。雄性生殖系統對溫度變化敏感，由于睪丸血管相對缺乏，血流不暢，散熱困難，易造成睪丸損傷。研究表明，短時間的熱應激可引起雄性大鼠可逆性的睪丸損傷[9]。本研究表明，持續高溫環境可引起大鼠精子活力下降、存活率降低、畸形指數升高等。

表1　各組熱應激第7、14天大鼠CIP、CT比較±s)

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

表2　各組熱應激第7、14天大鼠精子相對計數、精子畸形指數比較±s)

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

表3　各組熱應激第7、14天大鼠血清SOD活性和MDA水平比較±s)

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

表4　各組熱應激第7、14天大鼠睪丸組織SOD活性和MDA水平比較±s)

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

熱應激過程中睪丸和生精細胞產生過氧化物、一氧化氮等[10]。研究表明，活性氧(ROS)在維持男性生殖生理功能如精子發育、細胞信號轉導、激素的產生、精子獲能、頂體反應以及精子活力等方面發揮重要作用。感染或炎癥時ROS水平升高與精子發育、功能和生殖能力障礙有關。當ROS的產生超過生殖系統抗氧化系統的清除能力時，則會對精子產生毒性作用，引起精子膜脂質過氧化，導致其形態、功能及代謝異常，甚或導致雄性不育。男性生育能力障礙歸因于環境因素，如接觸某些化學物質、重金屬、農藥、熱或電磁輻射、慢性壓力、吸煙、酗酒、肥胖、泌尿生殖創傷，男性生殖系統炎癥也與男性生育能力下降有關[11,12]。這些因素大部分是氧化應激的結果，導致氧化應激的原因是由于ROS和抗氧化系統失去平衡。過量的ROS引起病理反應導致細胞和組織的損傷。氧化應激影響精子活力，損害DNA結構，加速細胞凋亡，最終導致精子數量減少、運動障礙、形態異常以及功能損害。精子細胞膜含有大量的不飽和脂肪酸，可以發生脂質過氧化反應，而細胞質中只存在少量的能夠中和ROS的酶類。脂質氧化過程會導致膜完整性喪失和其滲透率的增加，細胞酶失活，DNA結構損傷和細胞凋亡[13,14]。SOD是細胞中主要的抗氧化酶之一，其在機體清除ROS的過程中起關鍵作用，SOD、過氧化氫酶也能阻止精子染色質的傷害，顯著增加精子運動性。MDA是過氧化脂質的分解產物，是減少精子生產的脂質過氧化作用的最終產物。MDA可作為細胞脂質過氧化反應強度的一個間接指標，通過對MDA的測定可反映體內自由基產生的程度。

《黃帝內經》認為“腎藏精”，主人體的生殖和發育。男性精子發育不良主要為腎精虧損，中醫辨證以腎虛為主。強精固腎湯具有補腎助陽、益精血、強筋骨、固精氣的作用。現代研究表明，微量元素鋅在預防生殖系統氧化損傷，改善生殖功能中作用明顯[15]。補腎壯陽藥有類激素樣作用，含鋅量高，對大鼠垂體性腺軸的影響顯著，能促進睪丸發育，促進精液分泌和精子質量，對改善睪丸曲細精管及間質細胞的損害均有一定效果。本研究結果表明，熱應激可以隨時間和強度聚集，導致精子的相對數量減少、畸形指數增加。與模型組比較，強精固腎湯能夠提高精子的相對數量，降低精子的畸形指數，提高血清和睪丸組織SOD活性，降低MDA水平，說明強精固腎湯能改善熱應激對雄性大鼠生殖系統的損傷，其作用機制可能與減輕生殖細胞的氧化損傷有關。

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2015年第55卷25期《不明原因復發性自然流產患者CCL17和CCR4水平的變化及意義》一文中的通信作者為譚玉潔。

本刊編輯部

Effect of Qiangjing Gushen decoction on male reproductive function of heat stress rats

ZHANGQi,HEZhiying,DONGJiaqi,WANGYidong,GAOJuntao

(JilinMedicalCollege,Jilin132013,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the protective effect of Qiangjin Gushen decoction on the heat stress-induced altered male reproductive function in rats and to investigate its possible mechanism. MethodsSixty male clean degree Wistar rats were randomly divided into the control group, model group, zinc sulfate group, low-dose, medium-dose and high-dose Qiangjing Gushen decoction groups which were orally administered with normal saline, normal saline, zinc sulfate, Qiangjin Gushen decoction 1000 mg/kg, 2000 mg/kg and 4000 mg/kg respectively for 30 d followed by exposure to heat 42℃, 1 h/d for 14 days (except for the control group). Sex ability was observed including the capture incubation period (CIP) and the capture time (CT). On the 7th and 14th of heat stress, we detected the number of sperm count and sperm deformity rate. Meanwhile, the superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) in the serum and testicular tissues were detected. Results Compared with the model group, on the 7th and 14th of heat stress, CIP of rats was shortened, CT was increased, the number of sperm count was increased and sperm deformity rate was decreased, the activity of SOD in the serum and testicular tissues was increased and the level of MDA in the serum and testicular tissues was decreased in the medium-dose and high-dose Qiangjing Gushen decoction groups (all P<0.05). All the above indexes had no significant statistical difference between the control group and the high-dose Qiangjing Gushen decoction group (all P>0.05). ConclusionQiangjing Gushen decoction can improve the male reproductive function of heat stress rats, and its mechanism may be related to the reduced oxidative damage of germ cells.

Key words:heat stress; Qiangjing Gushen decoction; reproductive function; oxidative damage; rats

(收稿日期：2015-11-04)

中圖分類號：R285.5;R691.6

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)09-0016-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.09.006

通信作者簡介：高俊濤(1976-)，男，副教授，博士，主要研究方向為神經生理學、熱損傷與防治。E-mail:15948628662@163.com

作者簡介：第一張祁(1996-)，男，本科，主要研究方向為熱損傷及其防治。E-mail:15143223805@163.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(31071042)；吉林省大學生創新創業訓練計劃項目(2015022)。