康復新在巨噬細胞炎癥反應中的抗炎作用及其機制

湯雁利，張玉皓，李罡，李啟艷

(1云南省第一人民醫院，昆明650032；2昆明理工大學附屬醫院；3昆明醫科大學附屬口腔醫院)

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康復新在巨噬細胞炎癥反應中的抗炎作用及其機制

湯雁利1,2，張玉皓1,2，李罡3，李啟艷1,2

(1云南省第一人民醫院，昆明650032；2昆明理工大學附屬醫院；3昆明醫科大學附屬口腔醫院)

摘要：目的觀察康復新在巨噬細胞炎癥反應中的抗炎作用，并探討其可能的作用機制。方法 將培養好的小鼠巨噬細胞RAW264.7隨機分為6組：A組(加入DMSO)、B組(加入DMSO)、C組(加入炎癥抑制藥物BAY11-7082)、D組(加入1%康復新)、E組(加入0.1%康復新)、F組(加入0.01%康復新)，藥物干預后繼續培養1 h，A組加DMEM培養液，其余各組加入LPS(100 μg/L)誘導細胞產生炎癥反應。造模后4、8 h收集細胞，用qRT-PCR法檢測細胞中白細胞介素(IL)6、腫瘤壞死因子(TNF)α、前列腺素內過氧化物合酶(PTGS)2的mRNA表達。結果造模后4、8 h，與A組比較，B組IL-6、TNF-α、PTGS2的mRNA表達水平均升高(P均<0.05)；與B組比較，C組IL-6、TNF-α、PTGS2的mRNA表達均降低(P均<0.05)。D組在收集細胞時即觀察到細胞全部死亡。與B組比較，E、F組IL-6、TNF-α的mRNA表達升高，PTGS2的mRNA表達降低(P均<0.05)；與C組比較，E、F組IL-6、TNF-α的mRNA表達差異有統計學意義(P均<0.05)，而PTGS2的mRNA表達差異無統計學意義(P均>0.05)。康復新的濃度、作用時間對IL-6、TNF-α、PTGS2的mRNA表達無影響。結論 康復新對巨噬細胞炎癥反應有抑制作用，該作用不是通過抑制IL-6、TNF-α等致炎因子的表達，而是與降低PTGS2的表達有關。

關鍵詞：炎癥；康復新；抗炎；巨噬細胞；細胞炎癥模型

康復新液主要成分為多元醇和肽[1]，具有抗炎、促進組織修復、抗腫瘤等作用[2]，已用于治療兒科[3]、消化科[4]和口腔[5]的炎癥性疾病，但關于其抗炎機制的相關研究很少。白細胞介素(IL)-1β、IL-6及腫瘤壞死因子(TNF)α是參與炎癥過程的重要細胞因子，前列腺素(PG)內過氧化物合酶(PTGS)2是花生四烯酸轉化為PG的關鍵酶[6]。本研究于2012年10月~2013年2月采用康復新干預細胞炎癥反應模型，檢測模型中炎癥介質IL-6、TNF-α、PTGS2的表達，探討康復新的抗炎機制。

1材料與方法

1.1材料小鼠巨噬細胞RAW264.7購于中國科學院昆明細胞庫；康復新液由昆明賽諾制藥有限公司生產；LPS、核因子-κB抑制劑BAY11-7082均購于Sigma公司；TRIzol Reagent購于美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒和PCR引物均購于大連Takara公司；熒光定量PCR試劑盒購于北京康為世紀生物科技有限公司；胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素溶液均購于以色列Bioind公司；二甲基亞砜(DMSO)購于安徽合肥Biosharp公司。

1.2細胞培養和分組取生長良好的RAW264.7，以3×105/孔接種于12孔細胞培養板，用10%FBS及1%雙抗(100 U/mL青霉素+100 mg/L鏈霉素)的DMEM培養液在37 ℃、5% CO2培養箱中培養12 h后，棄去舊培養液，更換為含1% FBS及1%雙抗的DMEM培養液繼續培養12 h，經10% FBS及1%雙抗的DMEM培養液繼續培養。將上述細胞隨機分為6組，每組設3個復孔，A組(加入DMSO 1 μL+DMEM 9 μL)、B組(加入DMSO 1 μL +DMEM 9 μL)、C組(加入10 mmol/L BAY11-7082 1 μL +DMEM 9 μL)、D組(加入1%康復新10 μL)、E組(加入0.1%康復新10 μL)、F組(加入0.01%康復新10 μL)，藥物干預后細胞放入培養箱繼續培養1 h，A組加DMEM培養液5 μL，其余各組加入LPS(100 μg/L) 5 μL誘導細胞炎癥反應模型，造模后4、8 h收集細胞，擬提取RNA。D組在收集細胞時觀察到細胞全部死亡，故未進一步檢測。

1.3細胞中IL-6、TNF-α、PTGS2 mRNA檢測采用qRT-PCR法。按TRIzol Reagent說明書提取細胞總RNA，按試劑盒說明合成cDNA。PCR反應體系為10 μL(混合物5 μL、上下游引物各0.2 μL、cDNA模板3 μL及RNase-Free水補足10 μL)。各引物的序列分別為：GAPDH：F 5′TGTGTCCGTCGTGGATCTGA3′,R5′TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG3′;IL-6：F5′CCACTTCACAAGTCGGAGGCTTA3′，R5′CCAGTTTGGTAGCATCCATCATTTC3′;TNF-α:F5′GACTAGCCAGGAGGGAGAACAGA3′,R5′CCTGGTTGGCTGCTTGCTT3′;PTGS2:：F5′TGCCAGGCTGAACTTCGAAAC3′,R5′GCTCACGAGGCCACTGATACCTA3′。95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火、延伸1 min，擴增35～40個循環。按照熒光定量PCR試劑盒說明檢測各基因的表達，每組重復實驗3次。對反應產物進行相對定量分析。以GAPDH為參照基因，根據公式2-ΔΔCT計算目的基因的相對表達量。

2結果

造模后4、8 h，與A組比較，B組IL-6、TNF-α、PTGS2的mRNA表達均升高(P均<0.05)；與B組比較，C組IL-6、TNF-α、PTGS2的mRNA表達均降低(P均<0.05)。D組在收集細胞時即觀察到細胞全部死亡；與B組比較，E、F組IL-6、TNF-α的mRNA表達均升高，PTGS2的mRNA表達均降低(P均<0.05)；E、F組同時間點IL-6、TNF-α的mRNA表達比較差異無統計學意義(P均>0.05)；同一濃度康復新組不同時間點IL-6的mRNA表達比較差異無統計學意義(P均>0.05)，造模后8 h與4 h比較，TNF-α的mRNA表達降低(P均<0.05)；造模后4 h，E組與F組PTGS2的mRNA表達比較差異無統計學意義(P均>0.05)，造模后8 h，F組PTGS2的mRNA表達低于E組(P均<0.05)；E組造模后8 h與4 h比較PTGS2的mRNA表達降低(P均<0.05)，F組造模后8 h與4 h比較PTGS2的mRNA表達差異無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

3討論

IL-6和TNF-α被稱為促炎細胞因子，可活化炎性細胞，增強其吞噬、殺傷功能，釋放炎癥介質，直接殺滅微生物。同時，參與宿主免疫反應，導致組織損傷。此外，IL-6和TNF-α屬內源性致熱原，可作用于體溫調節中樞，引起發熱[7]。花生四烯酸可通過環氧合酶PTGS2途徑代謝為PG。PG在炎癥過程中可使血管擴張、血管通透性升高而導致水腫；促進微靜脈、毛細血管釋放淋巴因子；另外PG還具有致熱作用。目前研究發現，PTGS2與各種炎性毛細血管后微靜脈的通透性、白細胞的趨化作用、T淋巴細胞產生及疾病的發生、發展有關[8]。故本研究通過LPS誘導RAW264.7制作細胞炎癥反應模型，檢測炎癥介質IL-6、TNF-α、PTGS2的mRNA表達水平。核轉錄因子κB(NF-κB)是細胞中重要的轉錄調節因子，通過刺激病毒、TNF、細胞活化因子、淋巴毒素等活化進而誘導多種基因的表達，產生多種細胞因子參與炎癥反應[9]。NF-κB活化通路的抑制劑可以在慢性炎癥和癌癥的治療中發揮重要的作用[10]。BAY11-7082是一種NF-κB抑制劑，可以通過阻斷NF-κB信號通路的活化而起到抗炎作用，故本研究選擇BAY11-7082作為陽性對照。本研究結果表明，LPS成功誘導RAW264.7發生了炎癥反應，而BAY11-7082有效抑制了IL-6、TNF-α、PTGS2的mRNA表達。

表1　各組造模后4、8 h細胞中IL-6、TNF-α、PTGS2 mRNA相對表達量比較±s)

注：與A組同時間點比較，aP<0.05；與B組同時間點比較，bP<0.05；與C組同時間點比較，cP<0.05；與同組造模后4 h比較，dP<0.05；與E組同時間點比較，eP<0.05。

從傳統昆蟲中藥材蟑螂中提取的康復新具有理氣散結、補氣養陰、解毒生肌的功效。康復新通過多種機制產生了抗炎作用。陸允敏等[11]研究發現，康復新通過促進表皮生長因子表達修復黏膜，還可通過抑制激活蛋白-1、核因子、IL-4等炎性介質的表達產生抗炎作用。王路明等[12]研究結果顯示，康復新能夠降低單個核細胞IL-4、IL-5、IFN-γ、TNF-α細胞因子表達，其抗炎機制可能是降低上述細胞因子的表達。實驗顯示，康復新有顯著的鎮痛作用，并對炎癥引起的組織水腫和滲出具有明顯抑制作用[13]。

本研究通過檢測部分內源性炎癥介質來探討康復新的抗炎機制，與B組相比，E組和F組中IL-6、TNF-α的mRNA表達升高，而PTGS2的mRNA表達明顯降低；與C組比較，E組和F組IL-6、TNF-α的mRNA表達差異有統計學意義，PTGS2的mRNA表達差異無統計學意義，提示康復新藥液的抗炎機制不是通過降低致炎因子IL-6、TNF-α表達，可能是通過降低PTGS2的表達以抑制PG的產生發揮抗炎效應。本研究發現，造模后4 h時，F組與E組比較PTGS2的mRNA表達差異無統計學意義，造模后8 h，F組與E組比較PTGS2的mRNA表達顯著降低(P<0.05)，結果未顯示出抗炎效應與藥物濃度有相關性；E組造模后4 h與8 h PTGS2 mRNA表達比較差異有統計學意義，而F組比較差異無統計學意義，結果不能得出抗炎效應與時間有相關性，但可表明康復新藥效時間至少維持8 h。分析原因可能為康復新藥液成分多且復雜，不能明確藥液中具體起抗炎作用的成分，尚需進一步純化獲得其有效成分進行更深入的研究。

綜上所述，體外實驗證實，康復新可能抑制PTGS2的產生而發揮抗炎效應,而不是通過抑制致炎因子IL-6、TNF-α來產生抗炎效應。目前市場上的多種康復新液都是從美洲大蠊藥材提取液中分離、精制而成的生物制劑，各個廠家康復新液在配方上會有一定差別。

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Anti-inflammatory effect and mechanism of Kangfuxin in inflammatory response of macrophages

TANGYanli1,ZHANGYuhao,LIGang,LIQiyan

(1TheFirstPeople'sHospitalofYunnanProvince,Kunming650032,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the anti-inflammatory effects of Kangfuxin in cell inflammation of macrophages and to discuss the possible mechanism. MethodsThe cultivated mouse macrophages RAW264.7 were randomly divided into 6 groups: group A (added with DMSO), group B (added with DMSO), group C (added with anti-inflammation drug BAY11-7082), group D (added with 1% Kangfuxin), group E (added with 0.1% Kangfuxin), and group F (added with 0.01% Kangfuxin). We continued to cultivate for 1 h after drug intervention, group A was treaded with DMEM, the other groups were treated with LPS (100 μg/L) to induce cell inflammation. The cells were collected after treatment of 4 h and 8 h, the mRNA expression levels of IL-6, TNF-α and prostaglandin-endoperoxide synthase (PTGS2) were detected by qRT-PCR. ResultsFour hours and eight hours after modeling, compared with group A, the mRNA expression levels of IL-6, TNF-α and PTGS2 were increased in the group B (all P<0.05); compared with group B, the mRNA expression levels of IL-6, TNF-α and PTGS2 were decreased in the group C (all P<0.05). All cells were dead in the group D.Compared with group B, the mRNA expression of IL-6 and TNF-α was increased and the PTGS2 mRNA expression was decreased in the groups E and F (all P<0.05). Compared with group C, significant difference was found in the mRNA expression of IL-6 and TNF-α between groups E and F (all P<0.05), and no significant difference was found in the mRNA expression of PTGS2 between groups E and F (all P>0.05). The concentration and duration of Kangfuxin had no effect on the mRNA expression of IL-6, TNF-α and PTGS2.ConclusionKangfuxin has inhibitory effect on the cell inflammatory reaction, and its mechanism may be not related with the inhibition of expression of inflammatory factors, such as IL-6 and TNF-α, but be related with the down-regulated PTGS2 expression.

Key words:inflammation; Kangfuxin; anti-inflammation; macrophages; inflammatory response model

(收稿日期：2015-12-23)

中圖分類號：R364.5

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)09-0013-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.09.005

通信作者簡介：李啟艷(1971-)，女，主任醫師，博士，主要研究方向為牙周病的治療。E-mail：ynliqiyan@aliyun.com

作者簡介：第一湯雁利(1983-)，女，主治醫師，碩士，主要研究方向為牙周病的治療。E-mail：3937394@qq.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81160134)；云南省中青年學術和技術帶頭人后備人才資助項目(2012HB027)；云南省醫學學科帶頭人資助項目(D-201232)。