Th22細胞在卵巢癌惡性腹水中募集的機制

盧威順，覃山羽，姜海行，譚式輝，楊顯文，羅薇，盧東紅

(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021)

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Th22細胞在卵巢癌惡性腹水中募集的機制

盧威順，覃山羽，姜海行，譚式輝，楊顯文，羅薇，盧東紅

(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021)

摘要：目的觀察Tp2細胞在卵巢癌惡性腹水(MA)中的分布情況，探討其向腹腔內募集的可能機制。方法 選擇卵巢癌合并MA患者23例(觀察組)、健康女性13例(對照組)，用密度梯度離心法獲得MA和外周血中單個核細胞，流式細胞儀檢測MA和外周血中Tp2、Th17細胞構成比及Tp2細胞趨化因子表達水平，ELISA法檢測腹水上清液和外周血中IL-17、IL-22的水平，用Spearman秩相關分析變量間關系。結果觀察組MA中Tp2、Th17細胞構成比高于同組外周血和對照組外周血(P均<0.05)；觀察組MA中CCR4、CCR7、CD45RO型Tp2細胞構成比高于外周血，CD45RA、CD62L型低于外周血(P均<0.05)；MA中IL-17、IL-22水平高于同組外周血及對照組外周血(P均<0.05)；經Spearman秩相關分析，MA中Tp2細胞與Th17細胞構成比呈正相關(r=0.66，P<0.01)，IL-22水平與Tp2細胞、Th17細胞構成比呈正相關(r分別為0.55、0.54，P均<0.05)。結論 Tp2細胞可能通過趨化因子與炎癥細胞因子由外周血向卵巢癌MA中募集。

關鍵詞：卵巢腫瘤；惡性腹水；輔助T細胞22；細胞分化；細胞募集

晚期卵巢癌患者常伴惡性腹水(MA)，MA中含有大量淋巴細胞，是研究腫瘤免疫微環境的理想模型。輔助T細胞22(Tp2)表達趨化因子受體(CCR)6、CCR10和CCR4[1],主要產生白細胞介素(IL)22來發揮其免疫效用，是一個獨立的細胞亞群。初始CD4+T細胞經IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)誘導向Tp2細胞分化，而轉化生長因子(TGF)β抑制Tp2的分化[2]。Tp2細胞在皮膚的自穩調節和病理狀態、自身免疫性疾病、感染性疾病和腫瘤免疫中發揮重要作用。關于卵巢癌MA中Tp2細胞的研究尚未見報道。本研究旨在觀察卵巢癌MA中Tp2細胞的分布情況，探討Tp2細胞在腹腔內募集的可能機制。

1資料與方法

1.1臨床資料選擇2015年3月~2015年11月本院確診為卵巢癌合并MA的患者23例作為觀察組，均通過腹腔積液穿刺尋找惡性細胞和(或)腹腔鏡取腹膜活檢樣本確定卵巢癌合并MA，均未接受抗腫瘤治療，未使用糖皮質激素和甾體類抗炎藥。患者年齡46~72歲，腫瘤臨床分期：Ⅱ期8例、Ⅲ期11例、Ⅳ期4例，腫瘤病理類型：透明細胞癌3例、黏液性腺癌8例、漿液性腺癌12例。同期，選擇健康女性13例作為對照組，均經檢查排除卵巢疾病，年齡38~69歲。兩組年齡比較差異無統計學意義。本研究通過本院倫理委員會批準，受試者均簽署知情同意書。

1.2MA和外周血中Tp2細胞及其表型檢測采用流式細胞術。觀察組入院24 h內，使用標準腹腔穿刺術取得腹腔積液600 mL，并同時抽取空腹靜脈血10 mL；對照組于查體日晨抽取空腹靜脈血10 mL。離心(1 600 r/min,15 min)提取腹水上清液和外周血血清凍存于-80 ℃。HBSS重懸浮MA和外周血中的細胞，用密度梯度離心法獲得單個核細胞。將分離的細胞重懸于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，加入豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)(終濃度50 ng/mL)5 μL、離子霉素(終濃度1 μg/mL) 20 μL、莫能霉素(終濃度0.7 μg/mL)1 μL，在37 ℃、5% CO2條件下孵育刺激T細胞5 h。隨后用抗CD4、抗CCR4、抗CCR6、抗CCR7、抗CCR10、抗CD45RO、抗CD45RA、抗CD62L單克隆抗體對細胞膜表面染色標記，置于室溫孵育30 min，使用破膜劑破膜，加入抗IL-22、抗IL-17和IFN-γ單克隆抗體進行細胞內染色，4 ℃孵育30 min。并做同型對照組以確定抗體特異性及熒光補償。單克隆抗體分別為PerCP-cy5.5、PE、FITC、APC、AF647、AF488等用熒光標記。在12 h內使用流式細胞儀檢測Tp2、Th17細胞構成比和Tp2細胞表型，使用FCS ExpressV3軟件分析數據。

1.3MA和外周血中IL-22、IL-17水平檢測采用ELISA試劑盒檢測MA和外周血中IL-17、IL-22，按照試劑盒說明進行操作。采用CurveExpert1.4軟件繪制標準曲線，計算血清IL-22、IL-17水平。

2結果

2.1兩組Th17、Tp2細胞構成比比較觀察組MA中Tp2、Th17細胞構成比高于同組外周血和對照組外周血(P均<0.05)，見表1。

表1　兩組Th17、Tp2細胞構成比比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與同組外周血比較，#P<0.05。

2.2觀察組MA、外周血Tp2細胞趨化因子表達水平比較MA中Tp2細胞中CCR4、CCR7、CD45RO表達水平高于外周血，CD45RA、CD62L表達水平低于外周血(P均<0.05)，見表2。

表2　觀察組MA、外周血不同表型Tp2細胞構成比比較

注：與外周血比較，*P<0.05。2.3兩組IL-17、IL-22水平比較觀察組MA中IL-17、IL-22水平高于同組外周血及對照組外周血(P均<0.05)，見表3。

2.4觀察組MA中Tp2細胞、 IL-22與Th17細胞、Tp2細胞的相關性經Spearman秩相關分析，MA中Tp2細胞與Th17細胞構成比呈正相關(rs=0.66，P<0.01)，IL-22水平與Tp2細胞、Th17細胞構成比呈正相關(rs分別為0.55、0.54，P均<0.05)。

表3　兩組IL-17、IL-22水平變化

注：與對照組比較，*P<0.05；與同組外周血比較，#P<0.05。

3討論

卵巢癌患者淋巴管易被癌細胞阻塞，且腫瘤細胞轉移至腹腔及大網膜對其產生刺激作用，導致血漿蛋白滲漏和液體積聚形成MA。卵巢癌腹腔微環境內CD4+CD25+Treg具有免疫抑制功能，該功能與卵巢癌分期及復發相關[3]。卵巢癌晚期，腫瘤部位和腹水中有大量CD4+CD25+Treg細胞聚集，其作用機制與抑制性細胞因子TGF-β1和IL-10的分泌有關[4]。初始CD4+T細胞在IL-6 和TNF作用下向Tp2 細胞分化，目前，關于Tp2細胞在卵巢癌MA中的表達情況和募集機制國內外尚未見報道。

本研究結果顯示，卵巢癌患者MA中Tp2細胞和Th17細胞構成比明顯高于同組外周血和對照組外周血，所以MA微環境可能促進Tp2細胞的分化。初始Th細胞在TGF-β和IL-6的刺激下可分化成為Th17細胞，分泌IL-17和IL-22。Ye等[5]證實,Th17細胞在抗腫瘤免疫中具有保護作用, 且能促進腫瘤特異性細胞毒性T細胞的免疫應答。本研究發現，MA中Th17細胞構成比和IL-17水平明顯高于同組外周血和對照組外周血，提示Th17細胞和IL-17在卵巢癌腫瘤微環境中很可能發揮免疫效應。而MA中Tp2細胞與Th17細胞構成比、IL-22水平呈正相關，因此Tp2細胞的分化機制可能與Th17相近。Tp2細胞與卵巢癌的發生發展有密切關系。IL-22是Tp2細胞的主要生物效應因子[6]。在腫瘤免疫方面，IL-22自身并不促進腫瘤形成，然而其通過上調下游基因Bcl-2、Bcl-XL、CyclinD1和血管內皮細胞生長因子促進腫瘤的生長和轉移[7]。IL-22既能保護肝臟，另一方面也能使肝細胞增殖能力增強，使得肝癌易感性增加[8]，在進展期原發性肝癌中IL-22表達水平明顯高于早期。胃癌組織中Tp2細胞也表現出類似情況，且與胃癌進展和患者生存率相關[9]。本研究結果顯示，IL-22在卵巢癌患者MA和外周血中濃度均高于健康對照組，提示IL-22在卵巢癌的發生發展過程中可能發揮同樣的作用。

有研究表明，惡性胸腔積液中趨化因子CCL20、CCL22 和CCL27水平較高，而這3種趨化因子的受體CCR4、CCR6、CCR10在惡性胸腔積液患者體內的Tp2細胞上高表達[10]。本研究結果表明，卵巢癌患者MA中Tp2細胞同樣高表達CCR4、CCR6、CCR10，因此可能是MA微環境中的趨化因子將Tp2細胞從外周血募集到腹腔積液內，使卵巢癌MA中Tp2細胞構成比明顯高于同源外周血和對照組外周血。不表達CCR7的CD45RA-T細胞呈現效應T細胞的特征，可向感染灶遷徙；表達CCR7的CD45RA-T細胞在接觸抗原后具有淋巴結歸巢能力，即具有中央記憶性細胞特點。本研究結果表明，在外周血Tp2細胞中CCR7表達低于MA，因此Tp2細胞由外周血向腹腔募集；MA中Tp2細胞低表達CD62L和CD45RA，高表達CD45RO，顯示中央記憶性細胞的特點。

綜上所述，卵巢癌MA中的趨化因子與炎癥細胞因子可能促進Tp2和Th17細胞由外周血向腹腔內遷移，Tp2細胞可能參與卵巢癌MA的發病過程并發揮一定的免疫調節作用。

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Recruitment mechanism of Tp2 cells in malignant ascites of ovarian cancer

LUWeishun,QINShanyu,JIANGHaixing,TANShihui,YANGXianwen,LUOWei,LUDonghong

(TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the distribution of Tp2 cells in malignant ascites (MA) of ovarian cancer and to investigate its recruitment mechanism in the abdominal cavity. MethodsTwenty-three cases of ovarian cancer patients with MA (observation group ) and 13 healthy women (control group) were selected. Density gradient centrifugation was used to collect the mononuclear cells from MA and peripheral blood. The proportion of Th17 and Tp2 cells from MA and peripheral blood, and the expression of chemokines in Tp2 cells were detected by flow cytometry. The levels of IL-17 and IL-22 in MA and supernatant were examined by ELISA, and the correlations between Tp2 cells and Th17 cells were determined by Spearman's rank correlation coefficients. ResultsThe proportion of Tp2 and Th17 cells in MA was significantly higher than that in peripheral blood from the observation group and control group (all P<0.05). In the observation group, the proportions of Tp2 cells in MA with CCR4, CCR7 and CD45RO were higher and the proportions of Tp2 cells in MA with CD45RA and CD62L were lower than those in the peripheral blood (all P<0.05). The levels of IL-17 and IL-22 in MA were higher than those from the peripheral blood in the observation group and control group (all P<0.05). Spearman's rank correlation coefficients showed that the proportion of Tp2 cells was positively correlated with the proportion of Th17 cells in MA (r=0.66, P<0.01), the level of IL-22 had a positive correlation with the proportion of Tp2 cells and Th17 cells in MA (r=0.55, 0.54; all P<0.05). ConclusionsTp2 cells may be recruited from peripheral blood to MA of ovarian cancer by chemokines and cytokines.

Key words:ovarian neoplasms; malignant ascites; helper T cells 22; cell differentiation; cell recruitment

(收稿日期：2015-12-04)

中圖分類號：R737.31

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)09-0007-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.09.003

通信作者簡介：覃山羽(1973-)，女，教授，博士，主要研究方向為Th9在惡性腹腔積液中的作用機制。E-mail: qsy0511@163.com

作者簡介：第一盧威順(1987-)，男，碩士，主要研究方向為Tp2細胞及其免疫微環境對惡性腹水的影響機制。E-mail:xw189@126.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81260083;31360221)