藁本內酯對低灌注大鼠水迷宮成績的改善和對海馬神經元保護作用

王成牛，馮展波，彭彬，李潔佳，陸亞鵬，朱俐

(1.南通大學醫學院 基礎醫學研究中心，江蘇 南通　226001; 2.南通大學 航海醫學研究所，江蘇 南通　226001)

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藁本內酯對低灌注大鼠水迷宮成績的改善和對海馬神經元保護作用

王成牛1，馮展波2，彭彬2，李潔佳1，陸亞鵬2，朱俐2

(1.南通大學醫學院 基礎醫學研究中心，江蘇 南通226001; 2.南通大學 航海醫學研究所，江蘇 南通226001)

[摘要]目的：研究藁本內酯對低灌注大鼠水迷宮成績的改善和對海馬神經元的保護作用，探討其神經元保護的作用機制。方法：取健康雄性SD大鼠24只(體重260～280 g)，隨機分為對照組、低灌注組和藁本內酯組，每組8只。對低灌注組和藁本內酯組大鼠行雙側頸總動脈永久性結扎術，對照組不結扎。術后第8天，藁本內酯組大鼠灌胃給予藁本內酯(以大豆油為溶劑，每日劑量80 mg·kg(-1))，另外兩組大鼠予相同體積的大豆油灌胃。所有大鼠連續灌胃21 d后進行水迷宮實驗，觀察各組大鼠水迷宮成績(即潛伏期的長短)的差異。水迷宮實驗結束后處死大鼠，采用尼氏染色觀察各組大鼠海馬CA1和CA3區神經元尼氏小體陽性細胞數量的變化，采用免疫熒光和免疫組化法觀察各組大鼠海馬CA1和CA3區神經元的神經元特異性核蛋白(NeuN)、神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)和半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3(Caspase3)表達變化。結果:藁本內酯組大鼠水迷宮成績較低灌注組明顯提高(P<0.05)，海馬CA1、CA3區尼氏小體陽性細胞數量較低灌注組明顯增加，海馬CA1、CA3區GFAP和Caspase3陽性細胞數量較低灌注組明顯減少。結論:藁苯內酯能夠改善低灌注大鼠水迷宮成績,并對海馬區神經元具有較好的保護作用。

[關鍵詞]藁本內酯； 腦低灌注； 神經保護； 海馬； 凋亡

藁本內酯(Ligustilide)可透過血腦屏障，改善腦微循環、抗氧化損傷、抑制炎癥反應，并可提高膽堿乙酰轉移酶活性，有利于改善記憶功能[1- 6]。本課題中，我們研究藁本內酯對低灌注大鼠水迷宮成績的改善和對海馬神經元的保護作用，并探討藁本內酯神經保護作用的機制，為其臨床應用提供實驗參考。

1材料與方法

1.1實驗動物與模型制備

健康雄性清潔級SD大鼠24只(260～280 g)，由南通大學醫學實驗動物中心提供。將大鼠隨機分為對照組、低灌注組和藁本內酯組，每組8只。對低灌注組和藁本內酯組大鼠行雙側頸總動脈永久性結扎術，對照組不結扎。術后第8天，藁本內酯組予藁本內酯灌胃(以大豆油為溶劑，每日劑量80 mg·kg-1)，另外兩組大鼠予相同體積的大豆油灌胃。

1.2主要試劑和器材

藁本內酯(本實驗室制備，純度：95%～97%)，鼠抗GFAP一抗、鼠抗NeuN一抗(Millipore，美國)，兔抗Caspase3一抗、FITC羊抗鼠二抗及TRITC 羊抗兔二抗(Bioworld，美國)，抗鼠/兔二抗試劑盒(北京中杉金橋)，其他試劑為國產分析純。熒光顯微鏡、冰凍切片機(萊卡，德國)，水迷宮(北京，中國藥物科學院)。

1.3實驗方法

大鼠連續灌胃21 d后進行連續5 d的水迷宮實驗，實驗流程見本課題組前期報道[7]，由電腦自動記錄大鼠潛伏期時間。水迷宮實驗結束后處死大鼠取腦，制備冰凍切片，切片厚度25 μm。取切片行尼氏染色，觀察各組大鼠海馬CA1和CA3區神經元尼氏小體陽性細胞數量的變化；采用免疫熒光和免疫組化法觀察各組大鼠海馬CA1和CA3區神經元的神經元特異性核蛋白(neuronal specific nuclear protein，NeuN)、神經膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)和半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Caspase3)表達變化。

1.4統計學處理

2結果

2.1藁本內酯能有效提高低灌注大鼠水迷宮成績見圖1。

與對照組比較，aP<0.01；與低灌注組比較，bP<0.05

圖1各組大鼠水迷宮潛伏期結果

圖1顯示，隨著實驗天數的增加，各組大鼠的潛伏期出現差異。從第3天開始，低灌注組大鼠的潛伏期較對照組大鼠的潛伏期明顯延長(P<0.01)，即水迷宮成績變差；從第4天起，藁本內酯組大鼠的潛伏期較低灌注組大鼠的潛伏期明顯縮短(P<0.05)，即水迷宮成績提高。

2.2藁本內酯能有效抑制低灌注大鼠海馬尼氏小體陽性細胞數量的減少見表1。

表1各組大鼠海馬CA1、CA3區尼氏小體陽性細胞數量與對照組平均值的比值

組 別海馬CA1區海馬CA3區對照組1±0.031±0.03低灌注組0.42±0.08a0.56±0.07a藁本內酯組0.94±0.04b0.91±0.03b

與對照組比較，aP<0.01；與低灌注組比較，bP<0.01

表1顯示，低灌注組大鼠海馬CA1、CA3 區尼氏小體陽性細胞數量與對照組平均值的比值較對照組明顯減小(P<0.01)，藁本內酯組海馬CA1、CA3區尼氏小體陽性細胞數量與對照組平均值的比值較低灌注組明顯增大(P<0.01)。

2.3藁本內酯能有效抑制低灌注大鼠海馬GFAP陽性細胞的增加見表2。

表2各組大鼠海馬CA1、CA3區GFAP陽性細胞數量與對照組平均值的比值

組 別海馬CA1海馬CA3對照組1±0.061±0.08低灌注組1.65±0.12a1.5±0.12a藁本內酯組1.09±0.07b1.14±0.11b

與對照組比較，aP<0.01；與低灌注組比較，bP<0.01

表2顯示，低灌注組大鼠海馬CA1、CA3區GFAP陽性細胞與對照組平均值的比值較對照組明顯增大(P<0.01)，藁本內酯組海馬CA1、CA3區GFAP陽性細胞數量與對照組平均值的比值較低灌注組明顯減小(P<0.01，表2)。

2.4藁本內酯能有效減少低灌注大鼠海馬Caspase3陽性細胞的增加見表3、圖2。

表3各組大鼠海馬CA1、CA3區Caspase3陽性細胞數量與對照組平均值的比值

組 別海馬CA1海馬CA3對照組1±0.211±0.09低灌注組7.12±11.2a3.2±0.36a藁本內酯組3.24±0.18b1.75±0.13b

與對照組比較，aP<0.01；與低灌注組比較，bP<0.01

A～C為海馬CA1區，D～F為海馬CA3區；A和D為對照組，B和E為低灌注組，C和F為藁本內酯組

圖2大鼠海馬區NeuN和Caspase- 3免疫熒光雙標結果

表3顯示，低灌注組海馬CA1和CA3區Caspase3陽性細胞與對照組平均值的比值較對照組明顯增大(P<0.01)；藁本內酯組海馬CA1和CA3區Caspase3陽性細胞數量與對照組平均值的比值較低灌注組明顯減小(P<0.01)。NeuN和Caspase- 3免疫熒光雙標結果顯示，低灌注大鼠的Caspase3陽性細胞與NeuN陽性細胞基本重疊。

3討論

大鼠水迷宮成績(即潛伏期的長短)是反映大鼠空間學習記憶功能的一項重要指標；而學習記憶功能的正常發揮與海馬神經元的活力和數量密切相關。尼氏小體是神經元糙面內質網的核糖體，也是神經細胞功能活性的形態指標。當神經元的軸突被切斷或受到過分的刺激時，尼氏小體會逐漸消失。NeuN是一種成熟的神經元標記物，不與星形膠質細胞和小膠質細胞發生交叉反應，其陽性細胞數量的多少，能更加準確地代表神經元的數量。本實驗中，藁本內酯組大鼠海馬CA1、CA3區尼氏小體陽性和NeuN陽性細胞數量(數據未給出)與對照組平均值的比值明顯大于低灌注組大鼠，說明藁本內酯治療后的大鼠海馬CA1、CA3區神經元的活力和數量指標較低灌注大鼠更好。藁本內酯組大鼠水迷宮成績較低灌注組大鼠明顯提高，正是這種生理性差異的直接體現。

在中樞神經系統中，炎癥因子NF- κB可廣泛表達于神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞。其在大鼠腦缺血神經細胞中表達升高。有研究發現，在腦出血神經元中Caspase3的表達與NF-κB的表達呈正相關[8]。本研究中，我們發現藁本內酯能夠有效減少低灌注大鼠海馬CA1、CA2區域GFAP和Caspase3陽性細胞，推測藁本內酯通過減少該區域Caspase3陽性細胞使炎癥因子NF- κB的表達減少，但是其確切的機制還需要進一步的實驗進行驗證。

綜上所述，藁本內酯能夠有效改善低灌注大鼠水迷宮成績，這種改善作用可能是通過抑制低灌注大鼠海馬CA1、CA3區域尼氏小體陽性細胞的減少，并且抑制該區域GFAP和Caspase3陽性細胞的增加實現的。雖然關于藁本內酯的神經保護作用機制不斷被發現和闡明，但是更深入的藥理機制仍有待進一步的研究，比如給藥后海馬區域正常神經元是來自于缺血前，還是缺血后的再生，還是兩者都有的問題尚未得到解決，這將是我們今后進一步研究的課題。

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doi：10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.02.019

[中圖分類號]R966

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671- 6264(2016)02- 0228- 04

[通信作者]朱俐E- mail:zhulili65@126.com

[作者簡介]王成牛(1985-),男，江蘇南京人，實驗師，醫學碩士。E- mail:wangchengniu@163.com

[基金項目]江蘇省科技廳高技術研究計劃基金(BG2007607)；南通大學校級自然科學類科研基金一般項目(12Z020)

[收稿日期]2015- 10- 10[修回日期] 2015- 12- 01

[引文格式] 王成牛，馮展波，彭彬，等.藁本內酯對低灌注大鼠水迷宮成績的改善和對海馬神經元保護作用[J].東南大學學報:醫學版，2016,35(2)：228- 231.

·論著·