血紅素加氧酶- 1對急性肝衰竭大鼠肝組織HMGB1及炎癥的影響

張志恒，李俊生，施曉雷

(1.東南大學 醫學院，江蘇 南京　210009； 2.南京鼓樓醫院 普外科，江蘇 南京　210008)

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血紅素加氧酶- 1對急性肝衰竭大鼠肝組織HMGB1及炎癥的影響

張志恒1，李俊生1，施曉雷2

(1.東南大學 醫學院，江蘇 南京210009； 2.南京鼓樓醫院 普外科，江蘇 南京210008)

[摘要]目的：探索血晶素(hemin)誘導血紅素加氧酶- 1(HO- 1)過表達對急性肝衰竭(急性肝衰)大鼠肝臟中高遷移率族蛋白B1(HMGB1)及相關炎癥因子的影響。方法：將96只SD大鼠按給藥方法不同分成4組，即對照組、急性肝衰、hemin(HO- 1誘導劑)組、鋅原卟啉(znpp，HO- 1抑制劑)組，每組24只。對照組腹腔注射生理鹽水；急性肝衰組腹腔注射D- Gal 0.8 g·kg(-1)及LPS 20 μg·kg(-1)制作肝衰竭模型；hemin、znpp組腹腔分別注射hemin 40 μmol·kg(-1)或znpp 50 μmol·kg(-1)，12 h后給予D- Gal和LPS，方法同急性肝衰組。檢測各組大鼠誘導后24、 72 h肝臟功能變化，比較4組大鼠肝臟組織病理學表現。應用RT- PCR及Western Blot檢測肝組織中HO- 1、HMGB1水平，ELISA檢測TNF- α及IL- 1β濃度；檢測HO- 1活性。結果：采用D- Gal和LPS成功建立了大鼠急性肝衰竭模型，與對照組比較，急性肝衰組谷氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、IL1β、TNF- α濃度及HMGB1水平均升高(P<0.05)，肝臟組織損傷嚴重。與急性肝衰組比較：hemin組HO- 1水平及活性上調，ALT、AST、IL1β、TNF- α濃度(P<0.05)及HMGB1水平顯著降低，肝臟組織損傷緩解；而znpp組HO- 1水平及活性降低， ALT、AST、IL1β、TNF- α濃度(P<0.05)及HMGB1水平升高，肝臟組織損傷加重。結論：在急性肝衰竭中HMGB1明顯增加，HO- 1的過表達可以緩解急性肝衰竭肝臟損傷，其機制與抑制HMGB1、IL1β、TNF- α的表達有關。

[關鍵詞]高遷移率族蛋白B1； 急性肝衰竭； 血紅素加氧酶- 1； 炎癥

急性肝衰竭(acute liver failure， ALF)是一種以短期肝功能快速丟失為特征的臨床重癥，其預后差、死亡率高[1]。近年研究表明，炎癥因子及高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein 1， HMGB1)在肝臟急、慢性疾病的不良轉歸中扮演重要角色[2]。損傷的肝臟細胞產生HMGB1，激活巨噬細胞相關的免疫反應，產生大量活性介質及炎癥因子，進而加重損傷器官中內環境的紊亂導致細胞死亡[3]。

血紅素加氧酶- 1(heme oxygenase- 1， HO- 1)是體內廣泛存在的一種可誘導酶。研究表明：其具有抗炎、抗氧化應激、抗凋亡的細胞保護作用[4]；在腎臟、肝臟、心臟及小腸損傷的模型中，HO- 1直接或間接發揮了保護作用，減輕了器官的損傷，其機制主要為抑制炎癥反應及細胞的凋亡[4- 7]；此外在酒精性肝損傷中，使用HO- 1誘導劑血晶素(hemin)或一氧化碳治療后，大鼠肝細胞的凋亡和氧化應激得到極大的抑制[8]。據此，本研究對ALF大鼠HO- 1的表達進行干預，觀察其對急性肝衰竭大鼠肝臟中HMGB1及炎癥因子的影響。

1材料與方法

1.1動物與主要試劑

SD雄性大鼠，體重210～240 g，鼠齡7～9周，購于南京鼓樓醫院動物實驗中心。D- Gal、LPS、hemin和鋅原卟啉(znpp，HO- 1抑制劑)及ELISA試劑盒購于Sigma公司，抗大鼠HO- 1、actin及HMGB1抗體購于Abcam公司，HO- 1活性試劑盒購于南京建成科技有限公司，總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒購于Invitrogen公司，SYBR GreenTaq購于日本TaKaRa公司，引物委托南京威靈生物有限公司設計合成。

1.2實驗方法

1.2.1模型分組與處理將96只大鼠按照給藥方法分為4組，每組24只。(1)對照組：腹腔注射等量生理鹽水；(2)ALF組：取D- Gal (0.8 g·kg-1)和LPS (20 μg·kg-1)給SD大鼠腹腔注射構建ALF模型；(3)hemin組：ALF造模前12 h腹腔注射hemin(40 μmol·kg-1);(4)znpp組：ALF造模前12 h腹腔注射znpp(50 μmol·kg-1)；在誘導ALF后24、72 h尾靜脈取血，檢測肝功能及炎癥因子，取肝組織行病理學檢查。

1.2.2HO- 1及HMGB1 mRNA表達檢測實時定量PCR法檢測HO- 1、HMGB1 mRNA；采用TRIzol法提取總

RNA。反應條件為95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃

延伸12 s；HO- 1上游引物:5- ACCCCACCAAGTTCAAA

CAG- 3；HO- 1下游引物: 5- GAGCAGGAAGGCGGTCTT

AG- 3；HMGB1上游引物：5- CTGGCTTATCCATTGGTGA

TGT- 3； HMGB1下游引物：3- CCTTTAGCTCTGTAGGC

AGCAA- 5；β- actin 上游引物: 5- GCGCTCGTCGTCGAC

AACGG- 3；β- actin 下游引物:5- GTGTGGTGCCAAATCT

TCTCC- 3； 檢測HO- 1、HMGB1基因的表達量，用β- actin為參照物，結果用2-△△Ct表示。

1.2.3HO- 1活性測定取肝組織置于液氮半小時后凍存于-80 ℃，使用試劑盒檢測HO- 1活性，操作方法嚴格按照其說明書進行。

1.2.4Western blot檢測肝組織HO- 1及HMGB1蛋白取大鼠肝臟制備蛋白樣品，加入SDS- PAGE凝膠電泳緩慢分離后轉膜60 min至PVDF膜。5%BSA室溫封閉2 h，加入HO- 1或HMGB1抗體(1︰1 000)，置4 ℃過夜。TBST洗5遍，置于ECL試劑A和試劑B中孵育5 min，X線片曝光，使用Image J軟件對條帶進行分析。

1.2.5血清TNF-α、IL- 1β及肝功能檢測血清中TNF-α及IL- 1β濃度使用ELISA試劑盒檢驗，操作方法嚴格按照說明書進行；用AU 2700全自動生化儀檢測肝功能。

1.2.6肝臟病理組織學觀察取新鮮肝臟組織固定于10%福爾馬林液，常規石蠟包埋，制作5 μm厚切片，使用蘇木精- 伊紅(HE)染色后光鏡下觀察各組肝組織病理學變化。

1.3統計學處理

2結果

2.1各組肝功能比較

與對照組比較，ALF組谷氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)升高(P<0.05)。與ALF組比較， hemin組ALT、AST明顯下降(P<0.05)；而znpp組ALT、AST顯著升高(P<0.05)。見表1。

U·L-1

與對照組比較，aP<0.05； 與ALF組比較，bP<0.05

2.2各組肝臟病理學觀察

對照組肝臟結構基本無異常，炎癥反應輕微。ALF組可見組織壞死，肝板解離，肝竇正常結構消失，淋巴細胞、中性粒細胞浸潤。與ALF組比較，hemin組肝臟損傷程度明顯緩解，炎性細胞浸潤減少；而znpp組肝臟結構破壞更加嚴重，伴隨單核細胞及淋巴細胞浸潤。見圖1。

圖1各組肝臟組織病理學結構HE染色×200

2.3各組肝內HO- 1及HMGB1 mRNA、蛋白水平和HO- 1蛋白活性檢測

與對照組比較，ALF組HO- 1、HMGB1 mRNA和蛋白水平升高(P<0.05)。與ALF組比較，hemin組HO- 1 mRNA、蛋白水平及HO- 1活性均顯著升高(P<0.05)，HMGB1 mRNA和蛋白水平顯著降低(P<0.05)；而znpp組HO- 1 mRNA和蛋白水平顯著降低，HO- 1活性、HMGB1水平顯著升高(P<0.05)。見圖2。

與對照組比較，aP<0.05； 與ALF組比較，bP<0.05

A.HO- 1 mRNA表達量； B.HO- 1活性； C.HMGB1 mRNA表達量； D.HO- 1和HMGB1蛋白表達量

2.4各組血清中炎癥因子水平變化見表2。

ng·L-1

與對照組比較，aP<0.05； 與ALF比較，bP<0.05

與對照組比較，ALF組血清中TNF-α和IL- 1β的濃度均升高(P<0.05)。與ALF組比較，hemin組TNF-α和IL- 1β的濃度均下降(P<0.05)；而znpp組TNF-α和IL- 1β濃度出現了輕微上升(P<0.05)。

3討論

急性肝衰竭是一種以快速和嚴重的肝細胞損傷為特征伴隨著全身炎癥反應的臨床重癥[1，9]。固有免疫系統的激活是ALF早期的重要特征之一，其中Kupffer細胞(KCs)是肝臟固有免疫系統的主要成分之一。Yan 等[10]的研究表明，在ALF的起始階段KCs呈爆發性的增殖、活化，同時產生的炎癥因子(如TNF-α和 IL- 1β)對肝臟進行二次損傷。HMGB1是激活KCs的重要介質之一，KCs細胞激活后同樣能釋放大量HMGB1，最終形成一個惡性循環。然而，Antoniades等[11]的研究證明，在ALF的后期KCs的促炎活性受到抑制，肝臟功能不斷恢復，說明通過調節KCs可能是干預ALF的潛在方向之一，HMGB1作為KCs功能的重要參與者需要深入觀察研究。

當組織損傷時，HMGB1可由損傷或壞死的細胞及活化的免疫細胞釋放至外周環境中，通過激活TLR4或Rage受體，繼而活化NF-κB通路釋放大量促炎因子，同時趨化中性粒細胞至損傷部位，最終加重局部組織的損傷[3，12- 13]；說明HMGB1水平的升高與不良結局相關。本實驗中使用LPS/D- Gal誘導ALF后，與對照組比較，ALF組肝臟組織出現大量壞死和免疫細胞浸潤，HMGB1水平、血清TNF-α和 IL- 1β的濃度均升高；因此，HMGB1是在ALF中有著重要的地位，通過調節HMGB1水平可能是干預ALF的潛在方向之一。

HO是維持細胞內穩定的重要蛋白，廣泛存在于細胞內，有3種同分異構體，即HO- 1、HO- 2和HO- 3，其中多種情況可以誘導HO- 1產生，具有抗炎、抗氧化和免疫調節的功能[14]； HO- 1通過抑制炎癥小體的形成，進而抑制 NF-κB 通路的激活，使其下游的IL- 1β濃度下降，最終保護內皮的功能[15]；在胎盤組織中，HO- 1可以通過擴張血管促進胎盤血流灌注，對胎兒起保護作用[16]；Tao等[17]同樣發現，HO- 1可以通過抗炎、抗凋亡及促進肝細胞增殖，繼而緩解ALF。以上研究說明，HO- 1在炎性疾病中具有保護作用。我們的實驗發現，ALF組中HO- 1水平出現升高，證實HO- 1可以在損傷的組織內升高，這可能是細胞的一種自我保護機制[18]；當使用hemin誘導HO- 1后，大鼠ALT、AST出現明顯下降，病理學顯示HO- 1緩解了肝臟炎癥細胞浸潤及肝細胞的壞死，同樣HMGB1的水平也被HO- 1抑制，外周血TNF-α和 IL- 1β濃度也出現下降。但是，當使用HO- 1抑制劑znpp后，大鼠的HMGB1水平及轉氨酶、TNF-α、IL- 1β濃度相對于ALF組都出現了輕度的回升。

綜上所述,hemin可以減輕D- Gal/LPS誘導的大鼠ALF，其機制為上調HO- 1水平及其活性，進而抑制HMGB1、IL1β、TNF-α的表達。

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Effects of HO- 1 on the expression of HMGB1 and inflammatory cytokines in rats with acute liver failure

ZHANG Zhi- heng1，LI Jun- sheng1，SHI Xiao- lei2

(1.SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China;2.DepartmentofGeneralSurgery，NanjingDrumTowerHospital，Nanjing210008，China)

[Abstract]Objective： To investigate the effects of upregulation of heme oxygenase- 1 with hemin on the expression of liver HMGB1 and associated inflammatory cytokines in rats during acute liver failure. Methods: Ninety six SD rats were divided into 4 groups (n=24) according to the processing conditions: control group， acute liver failure(ALF) group， hemin(HO- 1 inducer) group， znpp(HO- 1 inhibitor) group. Acute liver failure model was induced by intraperitoneally injection of D- Gal (0.8 g·kg(-1))and LPS (20 μg·kg(-1))， control group was given the same volume of saline. Hemin (40 μmol·kg(-1) ) or znpp (50 μmol·kg(-1)) was given intraperitoneally starting from 12 hours before D- Gal and LPS administration. The level of ALT and AST were detected at 24， 72 h after injection and the liver histopathological sections were compared. RT- PCR and Western blot were used to calculate the mRNA and protein levels of HO- 1 or HMGB1 in liver. Serum IL1β and TNF- α concentration were measured by ELISA. HO- 1 activity was detected. ALF model were successfully induced. Results: ALF model were successfully induced by intraperitoneal injection of D- Gal and LPS. Compared with control group， the levels of ALT， AST， IL1β，TNF- α and HMGB1 in ALF group increased significantly(P<0.05)， the structure of liver was damaged severely. Compared with ALF group， hemin treatment markedly increased the levels of HO- 1 and HO- 1 activity which inhibited the levels of ALT， AST， IL1β，TNF- α and HMGB1(P<0.05); While znpp treatment inhibited the levels of HO- 1 and HO- 1 activity thus leading to the up regulation of ALT， AST， IL1β、TNF- α and HMGB1(P<0.05) which aggravated liver damage. Conclusion: The level of HMGB1 is in accordance with the severity of ALF. HO- 1 over- expression could ameliorate the damage of liver. Down- regulated HMGB1， IL1β and TNF- α might be its potential mechanism．

[Key words]high mobility group protein B1; acute liver failure; heme oxygenase- 1; inflammation

doi：10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.02.002

[中圖分類號]R459.7

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671- 6264(2016)02- 0171- 05

[通信作者]施曉雷E- mail：njsxl2000@163.com; 李俊生E- mail:Lijunshenghd@126.com

[作者簡介]張志恒(1991-)，男，江西撫州人，在讀碩士研究生，E- mail:zhangzhihengfly@163.com

[基金項目]國家自然科學基金(81170418)；江蘇省自然科學基金(BK20131084)；江蘇省普通高校研究生實踐創新計劃項目基金(SJLX15- 0078)資助項目

[收稿日期]2015- 11- 06[修回日期] 2016- 01- 04

[引文格式] 張志恒，李俊生，施曉雷.血紅素加氧酶- 1對急性肝衰竭大鼠肝組織HMGB1及炎癥的影響[J].東南大學學報:醫學版，2016，35(2)：171- 175.

·論著·