同種異基因皮膚移植對小鼠抗腫瘤效應的影響

夏玲芝，曹鵬，李妙晨，毛源，王偉，張厚智，沈傳來

(1.南京金域醫學檢驗所 臨床免疫實驗室，江蘇 南京　210042； 2.東南大學醫學院病原生物學與免疫學系，江蘇 南京　210009)

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同種異基因皮膚移植對小鼠抗腫瘤效應的影響

夏玲芝1，曹鵬1，李妙晨2，毛源1，王偉2，張厚智1，沈傳來2

(1.南京金域醫學檢驗所 臨床免疫實驗室，江蘇 南京210042； 2.東南大學醫學院病原生物學與免疫學系，江蘇 南京210009)

[摘要]目的：研究同種異基因皮膚移植的排斥反應對小鼠抗腫瘤能力的影響。方法:將BALB/c鼠(H- 2d基因型)分成同種皮膚移植組(C57BL/6鼠為供者，H- 2b基因型)、同系皮膚移植組(其他BALB/c鼠為供者)和未移植組，分別皮下接種C57BL/6鼠來源的黑色素瘤細胞(B16，H- 2b基因型)或者BALB/c鼠來源的骨髓瘤細胞(SP2/0，H- 2d基因型)，觀察移植排斥和腫瘤生長情況，檢測脾細胞群中的CD3+、CD8+T細胞和H- 2Kb同種反應性CD8+T細胞的比例以及腫瘤組織中CD3+T細胞的浸潤程度。結果:B16細胞接種同種皮膚移植組小鼠后瘤體生長緩慢，直至完全消失，而接種同系皮膚移植組小鼠和未移植組小鼠后瘤體生長迅速；SP2/0細胞接種同種皮膚移植組小鼠、同系皮膚移植組小鼠和未移植組小鼠后瘤體均生長迅速，3組之間差異無統計學意義。同種皮膚移植鼠脾細胞群中針對H- 2Kb移植抗原的同種反應性CD8+T細胞比例明顯高于同系皮膚移植鼠。結論:同種皮膚移植引起的排斥反應只對擁有同種異基因的腫瘤細胞具有排斥作用，而對與受者基因同源的腫瘤細胞并無明顯的交叉免疫反應。

[關鍵詞]同種皮膚移植； 免疫排斥； 腫瘤免疫治療

腫瘤具有復雜的免疫逃逸機制，因此機體產生的抗腫瘤免疫應答反應較弱。同種組織和器官移植時能激發機體強烈的移植排斥免疫反應，其原因是移植物細胞上有免疫原性很強的同種異體移植抗原，如主要組織相容性抗原(人為HLA，小鼠為H- 2)等。因此，在腫瘤患者身上進行同種異體皮膚移植可能會幫助機體打破腫瘤免疫耐受，增強機體的抗腫瘤免疫效應。目前此類研究報道很少。Yolcuoglu等[1]先建立了BALB/c鼠的同種皮膚移植模型，然后經腹腔注射腫瘤細胞。段學章等[2]對C56BL/6鼠先經皮下注射腫瘤細胞，然后施行同種皮膚移植。結果均提示同種皮膚移植排斥反應有助于機體對腫瘤細胞的排斥，但均未能明確腫瘤細胞株與皮膚移植鼠之間的種系關系。作者以C57BL/6鼠(H- 2b)為皮膚移植的供體，以BALB/c鼠(H- 2d)為皮膚移植的受體，建立小鼠皮膚移植模型，隨后在排斥發生之前分別接種來源于C57BL/6鼠的B16黑色素瘤細胞株和來源于BALB/c鼠的SP2/0骨髓瘤細胞株，觀察腫瘤的生長情況以及CD3+、CD8+T細胞和同種反應性T細胞的變化，以明確同種移植排斥反應對與移植物基因同源或非同源腫瘤細胞的成瘤時間和生長進度的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物和試劑

C57BL/6和BABL/c雌性小鼠(5～7周齡)購自于揚州大學模式動物中心，飼養于東南大學實驗動物中心SPF級動物屏蔽室，并在此完成動物實驗。小鼠黑色素瘤細胞株B16和小鼠骨髓瘤細胞株SP2/0均來自美國典型菌種保藏中心(ATCC)，由本實驗室保存。大鼠抗小鼠CD16/CD32單抗、PE標記的大鼠抗小鼠IgG1單抗購自BD Pharmingen公司，APC標記的大鼠抗小鼠CD3e單抗、FITC標記的大鼠抗小鼠CD8a單抗購自于eBioscience公司。H- 2Kb- Ig二聚體購自于美國Invitrogen公司。大鼠抗小鼠CD3單抗、HRP標記的兔抗大鼠IgG多抗及DAB免疫組化試劑均購自谷歌生物科技有限公司。流式細胞儀(FACSCalibur)購自BD Bioscience公司。

1.2實驗方法

1.2.1BALB/c鼠皮膚移植模型的建立及臨床觀察指標將供體鼠C57BL/6(同系移植則取其他的BALB/c鼠個體為供體)頸椎脫臼處死，剪去背部體毛，剪取背部1 cm×1 cm全層皮片，去除皮下筋膜和脂肪后移植于BALB/c鼠的背部植床上，用無菌創口貼適當加壓包扎固定[3]。術后單籠飼養，術后第3天打開包扎，每天觀察移植物的存活情況，觀察指標和評分標準參照文獻[4]：根據皮片皺縮、皮毛色澤、局部紅腫炎癥3項指標進行評分，計為0、1、2、3分，3分為無變化，分數越低表示排斥現象越嚴重。3項指標滿分即9分為完全無排斥現象。本實驗中皮片干縮至原來面積的2/5判為排斥。由于移植后前4 d處于傷口愈合期，且小鼠的同種皮膚移植排斥多發生在術后第6～7天，故本實驗從第5天開始每日記錄評分。

1.2.2皮膚移植鼠和未移植鼠的載瘤實驗將BALB/c鼠隨機分成3組：(1) 同種移植組，即BALB/c鼠移植來源于C57BL/6鼠的皮膚；(2) 同系移植組，即BALB/c鼠移植來源于其他BALB/c鼠個體的皮膚；(3) 未移植組，即BALB/c鼠不進行皮膚移植術。

取對數生長期的B16細胞(來源于C57BL/6鼠，H- 2Kb+)或者SP2/0細胞(來源于BALB/c鼠，H- 2Kd+)，臺盼藍染細胞確定活細胞數在95%以上，用無菌PBS調整細胞濃度備用。于皮膚移植后的第3天將腫瘤細胞接種于皮膚移植或未移植的BALB/c鼠背部皮下；每天用游標卡尺測量腫瘤組織大小，記錄腫瘤生長情況。B16細胞接種實驗分組如下：取未移植鼠和同系移植鼠分成兩組，每只鼠接種B16細胞2×106個，同時取同種移植鼠分成4個組，每組分別接種B16細胞2×106只-1、3×106只-1、4×106只-1和5×106只-1。當檢測免疫指標時，上述6組每組設小鼠5只；當觀察皮膚移植物的成活期時，上述6組中只做兩組：同系移植組(接種B16細胞2×106只-1)和同種移植組(接種B16細胞2×106只-1)，每組設10只小鼠。SP2/0細胞接種實驗分組如下：取未移植鼠和同系移植鼠分成兩組，每只鼠接種SP2/0細胞2×106個，同時取同種移植鼠另分成2個組，一組接種SP2/0細胞(2×106只-1)，另一組接種B16細胞(2×106只-1)。當檢測免疫指標時，上述4組每組設小鼠5只；當觀察皮膚移植物的成活期時，上述4組中只做兩組：同系移植組(接種SP2/0細胞2×106只-1)和同種移植組(接種SP2/0細胞2×106只-1)，每組設小鼠10只。

1.2.3載瘤鼠脾細胞群中CD3+T細胞、CD8+T細胞和H- 2Kb同種反應性T細胞比例的檢測各皮膚移植組小鼠接種瘤細胞后第17天處死，制作脾細胞懸液，用10%BSA- PBS調整細胞濃度后置于流式分析管中，加入抗小鼠CD16/32單抗(小鼠細胞IgG Fc段受體封閉劑)，充分混勻后置于4 ℃反應1 h，然后離心洗滌，去上清，細胞重懸于PBS中備用。另取1支流式管，加入4 μg H- 2Kb- Ig 二聚體和4 μg PE標記的抗小鼠IgG1(可以與二聚體中的Ig結合)，于4 ℃避光共孵育30 min，使之相互結合，然后加入經抗小鼠CD16/32單抗封閉的脾細胞管中(2×106個細胞·管-1)，于4 ℃避光反應1 h。同時在另一管中只加PE標記的抗小鼠IgG1和脾細胞，同上反應1 h，做陰性染色對照。各管離心洗滌后棄上清，每管補加APC標記的抗小鼠CD3e和FITC標記的抗小鼠CD8a單抗各1 μg，于4 ℃避光反應30 min。用PBS離心洗滌細胞2次，棄上清后細胞重懸于0.5 ml PBS中進行流式細胞檢測。用WinMDI 3.8或者CellQuest軟件分析兩個指標：(1) CD3+T細胞群中CD8+/PE- 抗小鼠IgG1+細胞的比例，即針對H- 2Kb抗原的同種反應性CD8+T細胞的比例；(2) 脾淋巴細胞群中CD3+T 細胞和CD8+T 細胞的比例。

1.2.4腫瘤組織免疫組化染色各皮膚移植組小鼠接種瘤細胞后第17天處死取瘤組織，常規制作冰凍切片。用PBS 洗滌后滴加封閉液(10%正常兔血清- PBS)，置37 ℃封閉30 min；而后PBS洗滌，滴加50 μl大鼠抗小鼠CD3一抗，覆蓋組織，置濕盒中4 ℃過夜；取出切片，室溫平衡30 min，PBS 洗滌后滴加HRP標記的兔抗大鼠IgG(1∶200)二抗，置濕盒中37 ℃孵育30 min；用PBS洗滌后滴加DAB顯色液，室溫顯色，鏡下控制反應時間，蒸餾水充分洗滌阻斷顯色反應；然后用蘇木素- 伊紅復染，1%鹽酸分化，脫水后中性樹脂封片、鏡檢。

1.3統計學處理

采用GraphPad Prism5 軟件作圖和統計分析。各組載瘤鼠的腫瘤生長曲線用Wilcoxon signed rank test分析組間差異；CD3+T、CD8+T的細胞比例以及同種反應性T細胞比例用雙側非配對t檢驗分析組間差異。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1同種皮膚移植鼠移植物的存活期見圖1。

A.各組小鼠皮膚移植物的Kaplan- Meier生存曲線圖; B.各組小鼠皮膚移植排斥的評分。與同系皮膚移植比較，aP<0.05

圖1同種皮膚移植物和同系皮膚移植物的存活期

圖1A顯示：同種移植組小鼠在第6～7天發生明顯的移植排斥現象，皮膚移植物的中位生存期(MST)為9 d；而同系移植組未見明顯的皮膚排斥現象。圖1B顯示：從移植后第7天開始，同種移植組的評分顯著低于同系移植組，提示發生了排斥反應(P<0.05，雙側t檢驗)。由于生存曲線圖是觀察出現移植排斥鼠的個數，雖然在第6～7天時有少數鼠出現排斥反應，但其臨床評分是取所有10只鼠臨床評分的平均值，所以與滿分的差異不大，但在第7天時與同系移植組比較已呈現統計學差異。上述移植排斥的結果與未注射腫瘤細胞的BALB/c鼠同種皮膚移植組差異無統計學意義(見作者前期實驗[5])。

2.2同種皮膚移植鼠抗同種異基因腫瘤和同系腫瘤的能力

2.2.1同種皮膚移植鼠抗同種異基因腫瘤的能力明顯增強見圖2。

A.B16移植瘤生長曲線; B.SP2/0及B16移植瘤生長曲線

圖2各組BALB/c實驗鼠皮下移植瘤的生長曲線

B16黑色素瘤細胞株來源于C57BL/6鼠，具有與C57BL/6鼠皮塊相同的移植抗原(H- 2b型)，因此是BALB/c鼠(H- 2d型)的同種異基因腫瘤。圖2A顯示，未移植組小鼠和同系移植組小鼠在接種B16細胞后第6天左右出現腫瘤，而后瘤體逐漸增大，至第23天時瘤體平均大小分別為(234.5±82.27) mm2和 (262.0±70.13) mm2，兩組間生長曲線差異無統計學意義(Wilcoxon signed rank test，P>0.05)；4個同種皮膚移植組中，盡管B16細胞接種數逐漸提高至5×106只-1，但4個劑量組的瘤體生長均緩慢，并從第10天后開始逐漸縮小，至第15～18天完全消失。上述結果說明，同種異基因皮膚移植能明顯增強機體對同種異基因腫瘤的抵抗作用，甚至能完全抑制同種異基因腫瘤的生長。

2.2.2同種皮膚移植鼠抗同系腫瘤的能力并未顯著提高SP2/0骨髓瘤細胞株來源于BALB/c鼠，因此是BALB/c鼠的同種同基因腫瘤(同系腫瘤)。結果如圖2B所示，未移植組、同系移植組和同種移植組小鼠在接種SP2/0細胞后第6天左右出現腫瘤，而后瘤體逐漸增大，至第25天時瘤體平均大小分別為(318.4±37.55)、 (334.2±86.82)和 (374.4±71.64)mm2，3組腫瘤生長曲線差異無統計學意義(Wilcoxon signed rank test，P>0.05)；第4組為同種異基因腫瘤的對照組，瘤體生長緩慢，直至消失，與圖2A的結果一致。這些結果提示，同種異基因皮膚移植排斥反應并不能顯著抑制與受者基因具有同源性的腫瘤的生長。

2.3各組載瘤鼠脾細胞群中同種反應性CD8+T細胞、CD3+和CD8+T細胞的比例見圖3。

在接種B16或SP2/0細胞后第17天，同種皮膚移植鼠接種B16細胞組的同種反應性CD8+T細胞比例顯著高于同系皮膚移植鼠接種B16細胞組[(4.048±0.402)%vs.(2.698±0.370)%，P=0.000 6]；同樣，同種皮膚移植鼠接種SP2/0細胞組的同種反應性CD8+T細胞比例也顯著高于同系皮膚移植鼠接種SP2/0細胞組[(2.424±0.159)%vs.(1.794±0.262)%，P=0.001 8)]。提示在皮膚移植后第20天同種移植鼠體內針對供體鼠H- 2b移植抗原的同種反應性T細胞仍然明顯多于同系移植鼠。同時，各組鼠脾細胞群中的CD3+T細胞比例和CD8+T細胞的比例均未見統計學差異，提示無論是同種移植或者同系移植的載瘤鼠，移植后第20天時外周T細胞總比例已無差異，但同種反應性CD8+T細胞的頻率在同種移植鼠中仍可見顯著增高。

2.4各組載瘤鼠腫瘤組織中CD3+T細胞的浸潤程度

各組皮膚移植鼠在接種B16或SP2/0細胞后第17天，腫瘤組織中的浸潤T淋巴細胞免疫組化分析結果見圖4。

A.各組脾細胞群的代表性流式分析圖； B.各組同種反應性CD8+T細胞比例(雙側非配對t檢驗)

圖3皮膚移植后第20天各組載瘤鼠脾細胞群中H- 2Kb同種反應性CD8+T細胞比例

A.同系移植鼠+B16細胞; B. 同種移植鼠+B16細胞; C. 同系移植鼠+SP2/0細胞; D. 同種移植鼠+SP2/0細胞

圖4皮膚移植后第20天各組載瘤鼠腫瘤組織中CD3+T細胞的浸潤×400

同種移植鼠接種B16細胞組的腫瘤組織細胞壞死明顯，浸潤CD3+T細胞(圖中呈褐色細胞)比其他3組稍多，但差異不顯著。其他3組腫瘤組織完整清晰，壞死不明顯，CD3+T細胞很少，其中同種移植鼠接種SP2/0組比兩個同系移植組的浸潤T細胞稍多。同系移植鼠接種B16細胞組的染色背景較強，但CD3+T細胞染色陽性的很少。

3討論

Yolcuoglu等[1]將BALB/c鼠分成實驗組和對照組，每組10只。實驗組鼠接受直徑1 cm的Swiss白鼠背部皮膚的移植，對照組鼠則接受同樣大小的來自同系BALB/c鼠的背部皮膚。第14天時每組小鼠經腹腔注射Ehrlich腹水瘤細胞，2 d后再次同上移植直徑2～3 mm的皮塊，然后觀察皮膚移植物和腫瘤的生長情況。結果顯示：同系皮膚移植組的10只對照鼠均在第18～25天內由于腫瘤生長而死亡；但在同種皮膚移植組中，2只鼠未見皮膚移植排斥，分別在第17天和第23天因腫瘤生長而死亡，其余8只鼠均在第9天左右出現皮膚移植排斥反應，并在4個月內均未見明顯的腫瘤生長等健康問題。這些結果提示同種異體皮膚移植排斥反應同樣有助于機體對腫瘤細胞的排斥，是腫瘤免疫治療的策略之一。遺憾的是，作者未能確定Ehrlich腹水瘤細胞是否與BALB/c鼠或Swiss白鼠的基因同源。Yoshida等[6]研究證明，同種異體移植物內浸潤的白細胞群在體外細胞培養中和在小鼠體內都能對基因同源性的腫瘤細胞發揮細胞毒作用，其中巨噬細胞為主要的細胞毒細胞、IFN-γ反應可能起著重要作用。2006年，Muir等[7]報道了利用同種異體皮膚移植治療晚期前列腺癌的Ⅰ期臨床研究，部分病例顯示有一定的療效。2008年，段學章等[2]將小鼠肝癌細胞株H22經皮下注射于C56BL/6鼠，而后第3天移植昆明鼠的同種異基因皮塊。結果顯示：同種異基因皮膚移植組小鼠的腫瘤生長均小于未移植組和自體移植組，差異有統計學意義(P<0.05)。值得注意的是，小鼠肝癌細胞株H22的遺傳背景應與實驗鼠C56BL/6不同，也非來源于皮塊供者昆明鼠。

以上研究盡管實驗方案各不相同，但結果都相似，即同種異基因移植能有效地增強移植鼠的抗腫瘤能力，甚至還有臨床Ⅰ期的實驗研究[7]結果證實。但是，本實驗觀察到同種移植引起的排斥反應只對擁有與供者同樣移植抗原的腫瘤細胞有排斥作用，外周同種反應性CD8+T細胞比例也顯著增多，而對與受者基因同源的腫瘤細胞并無明顯的交叉免疫效應。更多的治療方案以及T細胞的多時間點檢測仍值得進一步嘗試。

[參考文獻]

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Influence of allogeneic skin transplantation on the anti- tumor effects in mice

XIA Ling- zhi1，CAO Peng1，LI Miao- chen2，MAO Yuan1，WANG Wei2，ZHANG Hou- zhi1，SHEN Chuan- lai2

(1.ClinicalImmunologyLaboratory，NanjingKingMedMedicalDiagnosticsInstitute，Nanjing210042，China; 2.DepartmentofPathogenicBiologyandImmunology，SoutheastUniversityMedicalSchool，Nanjing210009，China)

[Abstract]Objective： To investigate the influence of skin allograft rejection on the anti- tumor effects in mice. Methods: BALB/c mice (H- 2d genotype) were randomly assigned to 1 of 3 groups named as allograft group grafted with skin from C57BL/6 mice (H- 2b genotype)，syngeneic graft group grafted with skin from other BALB/c mice，and no graft group，respectively.Each mouse was administered subcutaneously with melanoma cells (B16，H- 2b genotype) derived from C57BL/6 mouse，or myeloma cells (SP2/0，H- 2d genotype) derived from BALB/c mouse. The graft survival and tumor growth were then followed up. The percentages of spleen CD3+，CD8+T cell and H- 2Kb- alloreactive CD8+T cell as well as the infiltration of CD3+T cell in tumor tissue were detected. Results: After B16 cells injection，tumor progressed very fast in both syngeneic graft group and no graft group，but a marked reduction in melanoma growth was found in allograft group followed by a complete tumor regression. After SP2/0 cells administration，rapid tumor progression was found in allograft group，syngeneic graft group and no graft group，with no differences on tumor growth curves. A higher frequency of H- 2Kb- alloreactive CD8+T cells was detected in the allograft mice compared with the syngeneic graft mice. Conclusion: Alloskin graft rejection may facilitate the rejection of allogeneic tumor cells，but cannot cross- react with syngeneic tumor cells．

[Key words]allogeneic skin transplantation; immune rejection; tumor immunotherapy

doi：10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.02.001

[中圖分類號]R73.36; R392.4

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671- 6264(2016)02- 0165- 06

[通信作者]沈傳來E- mail:chuanlaishen@seu.edu.cn

[作者簡介]夏玲芝(1970-)，女，安徽合肥人，主管檢驗師。E- mail:labxialz@kingmed.com.cn

[基金項目]國家自然科學基金面上項目(81172823，81372448)

[收稿日期]2015- 09- 06[修回日期] 2015- 11- 26

[引文格式] 夏玲芝，曹鵬，李妙晨，等.同種異基因皮膚移植對小鼠抗腫瘤效應的影響[J].東南大學學報:醫學版，2016，35(2):165- 170.

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