烏塌菜與薹菜變種間雜交后代硫代葡萄糖苷組分及含量分析

馮希環 孫 艷 劉倩倩 汪俏梅 劉維信*

（1青島農業大學園藝學院，青島市園藝植物遺傳改良與育種重點實驗室，山東青島 266109；2浙江大學園藝系，農業部園藝植物生長發育與生物技術重點開放實驗室，浙江杭州 310029）

烏塌菜與薹菜變種間雜交后代硫代葡萄糖苷組分及含量分析

馮希環1孫 艷1劉倩倩1汪俏梅2劉維信1*

（1青島農業大學園藝學院，青島市園藝植物遺傳改良與育種重點實驗室，山東青島 266109；2浙江大學園藝系，農業部園藝植物生長發育與生物技術重點開放實驗室，浙江杭州 310029）

以烏塌菜品種上海小八葉、薹菜品種平度薹菜及變種間雜交后代6-1和6-5為試材，采用高效液相色譜法（HPLC）分析葉片及葉柄中硫代葡萄糖苷的組分與含量，以期了解不結球白菜變種間雜交后代的硫苷變化。結果表明：4份材料的葉片、葉柄中均檢測到組分相同的脂肪族硫苷、吲哚族硫苷各4種，而芳香族硫苷只在變種間雜交后代6-1的葉片和葉柄中檢測到；參試各材料葉片中總脂肪族硫苷含量、總吲哚族硫苷含量和總硫苷含量均高于葉柄。變種間雜交后代6-1葉片、葉柄中有益人體健康的2-苯乙基硫苷（NAS）和吲哚-3-甲基硫苷（GBC）含量均高于親本上海小八葉和平度薹菜，表明變種間雜交可以用于改良不結球白菜硫苷組分及含量。

烏塌菜；薹菜；變種間雜交；硫代葡萄糖苷；高效液相色譜法

硫代葡萄糖苷（glucosinolates，簡稱硫苷）又稱黑芥子苷、芥子油苷，廣泛存在于十字花科植物中，是一種含硫的次生代謝物質（Halkier & Gershenzon，2006）。在植物體中已鑒定出逾120種硫苷，根據側鏈R基團的不同可以分為3類：脂肪族硫苷、吲哚族硫苷、芳香族硫苷。硫苷及其降解產物與抵御病蟲害、構成十字花科蔬菜特殊風味以及抗癌作用等密切相關（Giamoustaris & Mithen，1995；Murillo & Mehta，2001；Tierens et al.，2001；Lankau，2007）。大量研究表明，食用蕓薹屬蔬菜可以降低癌癥的發生率（Nijhoff et al.，1995；Tawfiq et al.，1995；宋曙輝和薛穎，1997；汪俏梅和曹家樹，2001；王永飛 等，2004；Maria & Richard，2009）；但脂肪族硫苷、吲哚族硫苷、芳香族硫苷的抗癌活性及其作用機理不同（袁高峰等，2009）。硫苷及其降解產物的生物學效應在植物學、醫學、食品科學等許多領域中引起研究者的關注；同時，改變蕓薹屬蔬菜硫苷組分、提高其有益硫苷含量也成為蔬菜育種的新目標。

目前，硫苷與白菜類蔬菜風味形成關系的研究較深入。白菜類蔬菜風味的形成來源于3-丁烯基硫苷（gluconapin，NAP）、4-戊烯基硫苷（glucobrassicanapin，GBN）和苯乙基硫苷（gluconasturtiin，GNST）降解產生相應的異硫氰酸酯化合物（何洪巨 等，2002）。研究發現，3-丁烯基硫苷和4-戊烯基硫苷在所有白菜基因型中含量豐富（Padilla et al.，2007；Kim et al.，2010；Cartea et al.，2012）。Kliebenstein等（2001）報道，AOP2是控制3-丁烯基硫苷和4-戊烯基硫苷生成的關鍵基因。王輝等（2011a）推測，BrAOP可能是控制白菜中3-丁烯基硫苷生物合成的關鍵候選基因。硫苷的組分與含量在蕓薹屬不同植物種類間表現出很大變異（Rosa et al.，1997；李鮮 等，2006），這為選育高硫苷含量以及不同硫苷組分的白菜類蔬菜新品種奠定了基礎。起源于中國的白菜亞種的兩個變種——薹菜〔Brassica campestris L. ssp. chinensis（L.）Makino var. tai-tsai Hort〕和烏塌菜〔Brassicacampestris L. ssp. chinensis（L.）Makino var. rosularis Tsen et Lee〕是黃淮中下游地區深受群眾喜愛并廣泛栽培的特色蔬菜，關于薹菜的硫苷含量及組分已有報道（何洪巨 等，2002；宋延宇 等，2008），但鮮有關于烏塌菜硫苷組分的報道。筆者在前期分析不結球白菜種質資源時發現薹菜與烏塌菜硫苷含量以及組分均存在顯著差異（孫艷，2013），為探討通過變種間雜交選育不同硫苷含量及組分的白菜類蔬菜新品種的可行性，本試驗比較了烏塌菜品種上海小八葉和薹菜品種平度薹菜與它們的雜交后代間葉片、葉柄中硫苷組分及含量的變化。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試薹菜品種為平度薹菜自交系，烏塌菜品種為上海小八葉自交系，是青島農業大學白菜課題組分別從山東青島地方品種平度薹菜和上海地方品種上海小八葉經連續6代自交選育而成的親本材料。育種系6-1和6-5是由平度薹菜自交系與上海小八葉自交系雜交產生F1，再以上海小八葉自交系為輪回親本連續回交4代，在回交后代的自交群體中（BC4F2）篩選出的2個優良株系。

上述4份材料均于2014年9月1日播種于青島農業大學試驗田，10月9日定植，株距18 cm，行距20 cm，每小區30株，隨機區組排列，3次重復。11月9日取樣，每小區隨機選取5株，葉片與葉柄分別用液氮迅速冷凍，真空冷凍干燥（Virtis，USA）后研磨成粉末，置于-80 ℃冰箱中保存備用。

1.2 硫苷組分及含量分析

參照Jia等（2009）的方法，取0.1 g凍干粉于15 mL離心管中，加入5 mL ddH2O，沸水浴10 min后3 000 r·min-1離心10 min，采用Eppendorf移液器吸出提取液；再加入5 mL ddH2O，沸水浴10 min，再次離心（3 000 r·min-1，10 min），合并提取液，置于-20 ℃冰箱保存。

通過DEAE-Sephadex將提取液柱吸附、洗脫，得到純化樣品，過濾后進行HPLC（Waters，USA）分析。HPLC條件：檢測波長為226 nm，流速為110 mL·min-1，色譜柱為C18反相色譜柱。以oNPG為內標（響應因子為0.17），采用內標法計算硫苷含量。

1.3 數據處理

試驗數據采用Microsoft Excel 2003軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 烏塌菜、薹菜及變種間雜交后代葉片和葉柄中硫代葡萄糖苷構成

由圖1和表1、2可知，4份參試材料的葉片和葉柄中都檢測到了組分相同的4種脂肪族硫苷和4種吲哚族硫苷，其中4種脂肪族硫苷為：順-2-羥基-3-丁烯基硫苷（PRO）、5-甲基亞硫?；旎蜍眨?MSOP）、3-丁烯基硫苷（NAP）和4-戊烯基硫苷（GBN）；4種吲哚族硫苷為：4-羥基-3-吲哚基甲基硫苷（4OH）、吲哚-3-甲基硫苷（GBC）、4-甲氧吲哚-3-甲基硫苷（4ME）和1-甲氧吲哚-3-甲基硫苷（NEO）。而芳香族硫苷僅檢測到1種，即2-苯乙基硫苷（NAS），且只在變種間雜交后代6-1中檢測到，親本上海小八葉和平度薹菜中均未檢測到。

圖1 上海小八葉葉片中硫代葡萄糖苷檢測HPLC圖譜

2.2 烏塌菜、薹菜及變種間雜交后代葉片和葉柄中脂肪族硫苷含量

由表1、2可知，上海小八葉、平度薹菜和變種間雜交后代6-5的葉片和葉柄中的脂肪族硫苷含量均超過了總硫苷含量的50%，而變種間雜交后代6-1葉柄中的脂肪族硫苷含量只占總硫苷含量的35.33%；其中，6-5葉柄中的總脂肪族硫苷含量明顯高于其他3份材料。在參試材料所含的4種脂肪族硫苷中，PRO含量在上海小八葉、平度薹菜和6-1的葉片和葉柄中均為最低；而GBN含量占總硫苷含量的比例均為最高（除平度薹菜葉片外），其中上海小八葉葉片中GBN含量超過了總硫苷含量的50%。

2.3 烏塌菜、薹菜及變種間雜交后代葉片和葉柄中吲哚族硫苷含量

比較兩個親本材料可以看出，盡管平度薹菜的總吲哚族硫苷含量低于上海小八葉，但占總硫苷含量的比例卻高于上海小八葉，分別是后者的2.00倍（葉片）和1.44倍（葉柄）。而2份變種間雜交后代的總吲哚族硫苷含量的占比則出現明顯分化，6-1的總吲哚族硫苷含量的占比較高，與平度薹菜接近；6-5的總吲哚族硫苷含量的占比則低于上海小八葉（表1、2）。

2.4 烏塌菜、薹菜及變種間雜交后代葉片和葉柄中芳香族硫苷含量

在4份參試材料中，只有變種間雜交后代6-1的葉片和葉柄中檢測到芳香族硫苷NAS，葉片中的含量是葉柄中的2.05倍（表1、2）。

表1 烏塌菜、薹菜及變種間雜交后代葉片中硫代葡萄糖苷組成與含量

表2 烏塌菜、薹菜及變種間雜交后代葉柄中硫代葡萄糖苷組分及含量

3 結論與討論

本試驗結果表明，參試4份材料葉片中的總硫苷含量均高于葉柄，與陳新娟等（2006）、宋延宇等（2008）的報道一致。變種間雜交后代6-1和6-5葉片中總硫苷含量介于雙親之間，6-1葉柄中總硫苷含量也介于雙親之間，但6-5葉柄中總硫苷含量高于雙親，表明烏塌菜與薹菜雜交后代的總硫苷含量發生了變化。

本試驗中，親本與變種間雜交后代的葉片和葉柄中的NAP、GBN含量均較高；除平度薹菜葉片外，其余材料的脂肪族硫苷中均以GBN所占比例最高。王輝等（2011b）測定了64份普通白菜DH系材料硫苷成分的構成及含量，發現不同季節種植的普通白菜中NAP的占比平均在50%左右，GBN則平均未超過30%。本試驗中上海小八葉葉片和葉柄中GBN的占比均高于45%，變種間雜交后代6-5也獲得了上海小八葉該硫苷組分占比較高的性狀。

另一值得關注的是PRO，作為特殊風味物質前體（van Doorn et al.，1998），可能是致甲狀腺腫素5-乙烯唑烷-2-硫酮的前體（Heaney & Fenwick，1995），但亦有相反結果的報道（McMillan et al.，1986）。本試驗中變種間雜交后代6-5的PRO含量明顯高于兩個親本，而6-1與兩親本相近。

本試驗檢測到變種間雜交后代的硫苷組分較之親本不同，尤其是部分有益于人體健康的硫苷組分得以增加。芳香族硫苷NAS是蕓薹屬蔬菜的重要風味物質，其降解產物異硫氰酸鹽對白血病細胞增殖有顯著抑制作用（Adesida et al.，1996）。NAS在上海小八葉和平度薹菜中均未檢出，但6-1的葉片〔0.78 μmol·g-1（DW）〕和葉柄〔0.38 μmol·g-1（DW）〕中的NAS含量高于薹菜、蕪菁和普通白菜（宋廷宇 等，2008；孫文彥 等，2009；王輝 等，2011b），表明烏塌菜和薹菜雜交使部分后代的芳香族硫苷含量得到明顯提高。

另據報道，GBC的降解產物吲哚-3-甲醇具有一定的抗癌活性（Rosa & Heaney，1993）。本試驗中，變種間雜交后代6-1葉片中GBC含量高于親本上海小八葉和平度薹菜。

本試驗中烏塌菜與薹菜變種間雜交后連續回交，獲得的新品系在總硫苷含量和組分上均與親本不同，尤其是部分有益于人體健康的硫苷組分（NAS、GBC）得以增加，這可能與雜交導致的基因重組有關。新品系因硫苷組分變化獲得有益于人體健康的特性以及風味的變化有待于進一步驗證。

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Analysis of Glucosinolates Composition and Content in Filial Lines Derived from Inter-Varietal Cross of Savoy and Tai-tsai by HPLC

FENG Xi-huan1，SUN Yan1，LIU Qian-qian1，WANG Qiao-mei2，LIU Wei-xin1*
（1College of Horticulture，Qingdao Agricultural University，Qingdao Key Laboratory of Genetic Improvement and Breeding in Horticultural Plants，Qingdao 266109，Shandong，China；2Department of Horticulture，Zhejiang University，Key Laboratory of Horticultural Plant Growth，Development and Quality Improvement，Ministry of Agriculture，Hangzhou 310029，Zhejiang，China）

To understand the variation of glucosinolates composition in backcrossing lines derived from inter-varietal crosses in pakchoi，the content and composition of glucosinolates were analyzed by high performance liquid chromatography（HPLC）for savoy〔Brassica campestris L. ssp. chinensis（L.）Makino var. rosularis Tsen et Lee〕cv.‘Shanghaixiaobaye’，tai-tsai〔Brassica campestris L. ssp. chinensis（L.）Makino var. tai-tsai Hort〕cv.‘Pingdutaicai’，and 2 lines selected from F2populations of 4 times backcrossing of（‘Shanghaixiaobaye’בPingdutaicai’）with‘Shanghaixiaobaye’as the recurrent parent．The results showed that each of 4 kinds of aliphatic and indole glucosinolate were detected in the leaf and petiole of 4 tested materials．The total contents of aliphatic glucosinolate，indole glucosinolate and total glucosinolate in leaves were higher than petioles，and also different with 4 tested materials．The contents of health-beneficial compounds 2-phenylethyl glucosinolate（NAS）and glucobrassicin（GBC）were higher in leaves of‘6-1’than both its parents‘Shanghaixiaobaye’and‘Pingdutaicai’，indicating that inter-varietal crosses could be used in breeding new pakchoi cultivars with improved glucosinolate composition．

Savoy；Tai-tsai；Inter-varietal cross；Glucosinolate；HPLC

馮希環，碩士研究生，專業方向：蔬菜生理與育種，E-mail：15806584583@163.com

*通訊作者（Corresponding author）：劉維信，教授，碩士生導師，專業方向：白菜遺傳育種，E-mail：liuweixin2006@163.com

2016-09-19；接受日期：2016-11-11

國家自然科學基金項目（31401864），山東省自然科學基金項目（ZR2016CM15），青島市自主創新計劃應用基礎研究項目（16-5-1-74-jch）