葛根素固體脂質(zhì)納米粒制備工藝研究①

劉　娟，郭　宇，胡孟洋，翟美芳，平　洋，張靈芝，李雪欣，于　蓮

(1.佳木斯大學藥學院，黑龍江 佳木斯 154007；2.山東大學臨床醫(yī)學專業(yè)2012級4班，山東 濟南 250000)

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葛根素固體脂質(zhì)納米粒制備工藝研究①

劉娟1，郭宇1，胡孟洋2，翟美芳1，平洋1，張靈芝1，李雪欣1，于蓮1

(1.佳木斯大學藥學院，黑龍江 佳木斯 154007；2.山東大學臨床醫(yī)學專業(yè)2012級4班，山東 濟南 250000)

摘要：目的：研究葛根素固體脂質(zhì)納米粒的制備工藝。方法：采用乳化-超聲法制備葛根素固體脂質(zhì)納米粒，以單因素影響考察制備葛根素固體脂質(zhì)納米粒的工藝因素，通過正交試驗設計優(yōu)化制備工藝，并對包封率進行考察。結(jié)果：采用正交試驗篩選出的最佳工藝為制備溫度為78℃，加熱時間為10min，攪拌速度為900rpm，超聲時間為10min。根據(jù)篩選出的最佳工藝制備3批葛根素固體脂質(zhì)納米粒溶液，包封率為96.43%，載藥量為1.47%。結(jié)論：通過工藝的篩選制備得到葛根素固體脂質(zhì)納米粒澄明度較好，有藍色乳光，包封率和載藥量較高，本研究方法可作為制備葛根素固體脂質(zhì)納米粒的制備方法。

關(guān)鍵詞：葛根素；固體脂質(zhì)納米粒；制備工藝；研究

葛根為豆科植物野葛Pueraruia lobata(Willd1) Ohwi或甘葛藤Pueraruia thomsonii Benth1的干燥根，葛根素作為葛根中的主要藥效成分，其在臨床上主要用于治療腦梗死、高血壓、糖尿病、冠心病、心絞痛等疾病，對心、肝、腎具有保護作用[1]。但是由于葛根素結(jié)構(gòu)中具多苯環(huán)和多羥基的原因，其極性較大，水溶性較小，脂溶性也小，難以被胃腸道等生物膜吸收，口服生物利用度小于15%，限制了臨床的應用。為了延長葛根素在體內(nèi)血液循環(huán)的時間，提高葛根素的生物利用度，本文將用固體脂質(zhì)納米粒作為葛根素的藥物載體。固體脂質(zhì)納米粒(SLN) 是以生理相容的高熔點脂質(zhì)為骨架材料制成的納米粒。骨架材料在室溫下通常呈固態(tài)，因此既具備聚合物納米粒的物理穩(wěn)定性高藥物泄漏少的優(yōu)勢，又兼具脂質(zhì)體乳劑的毒性低能大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)點，是一種極有發(fā)展前景的新型給藥系統(tǒng)的載體[2~4]。

1儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；FA2004N電子分析天平(上海恒平科學儀器有限公司)；TGL-16M臺式高速冷凍離心機(長沙平凡儀器儀表有限公司)；冷凍干燥機(美國VirTis)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(河南省予華儀器有限公司)；JY92-2D超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；WD-A藥物穩(wěn)定性檢查儀(天津藥典標準儀器廠)；葛根素標準品(中國食品藥品鑒定研究院)；葛根素原料藥(陜西惠誠生物科技有限公司)；甲醇色譜純(天津市科密歐化學試劑有限公司)；甲醇(天津市科密歐化學試劑有限公司)；無水乙醇(天津市科密歐化學試劑有限公司)；甘露醇(北京化學試劑公司)；單硬脂酸甘油酯(天津市科密歐化學試劑有限公司)；泊洛沙姆(南京威爾化工有限公司)；水為純化水；其余試劑均為分析純。

2方法

2.1葛根素固體脂質(zhì)納米粒的制備

稱取葛根素10mg，加入甲醇定容至10mL，超聲溶解，得葛根素甲醇溶液；稱取單硬脂酸甘油酯150mg，加入少量無水乙醇將單硬脂酸甘油酯超聲溶解，得單硬脂酸甘油酯溶液；稱取泊洛沙姆125mg，加入蒸餾水溶解至25mL容量瓶，超聲溶解，得0.5%泊洛沙姆溶液。上述三種溶液加熱至78℃，將葛根素甲醇溶液與單硬脂酸甘油酯溶液混合得到油相，再將水相泊洛沙姆溶液緩慢滴加至油相中并攪拌，攪拌速度為900rpm，攪拌時間為10min，將初乳超聲，超聲功率60%，超聲破碎10min，冰水浴固化，過0.45μm水系濾膜，即得。

2.2葛根素體外分析方法的建立2.2.1最大吸收波長的測定

稱取葛根素對照品適量，用30%的乙醇溶解并稀釋，配成20μg/mL 的溶液備用。以30%的乙醇為空白溶液，在200～400nm 的波長范圍內(nèi)進行光譜掃描，取空白固體脂質(zhì)納米粒溶液適量，加入30%的乙醇超聲溶解并定容至10mL，同法對空白固體脂質(zhì)納米粒的30 %的乙醇溶液進行紫外掃描。

2.2.2色譜條件

色譜柱：C18(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：甲醇-水=40:60；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫；檢測波長：250nm；進樣量：10μL。

2.2.3專屬性考察

分別取3 mL空白葛根素固體脂質(zhì)納米粒溶液、對照品溶液和葛根素固體脂質(zhì)納米粒溶液置于10mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，過0.22μm濾膜，按上述色譜條件分別進樣10μL。

2.2.4標準曲線的制備

精密稱取葛根素標準品適量，用30%的乙醇配置成5個不同濃度的一系列標準溶液。按上述確定的色譜條件，分別取10μL進樣，以峰面積(A)對葛根素的濃度(C)進行線性回歸。

2.2.5精密度試驗

分別取三種濃度的葛根素標準溶液各5份，一天內(nèi)重復進樣5次，計算日內(nèi)精密度；將葛根素標準溶液放置4℃冰箱內(nèi)，并每天進樣1次，連續(xù)進樣5d，計算日間精密度。

2.2.6回收率試驗

精密吸取不同體積葛根素儲備液于容量瓶中，配制成三種不同濃度的葛根素溶液，記錄色譜圖和峰面積，代入標準曲線計算葛根素濃度。以實際濃度與相應理論濃度之比，計算方法回收率。

2.2.7定量限和檢測限

在前述色譜條件下，配制一系列已知低濃度葛根素標準品溶液，用0.22μm微孔濾膜過濾，進樣10μL，并測定其信號。

2.3葛根素基本理化性質(zhì)研究2.3.1溶解性質(zhì)考察

將葛根素溶解在甲醇、無水乙醇、乙醚和30 %的乙醇溶劑中，觀察各溶劑內(nèi)葛根素的溶解情況。

2.3.2油水分配系數(shù)的測定

本實驗用正辛醇法測定油水分配系數(shù)。精密量取適量的葛根素放入水中，超聲溶解，采用以上色譜條件測定葛根素在水中的濃度，記C0。將用水飽和過的正辛醇及上述溶液裝入三角瓶中，混勻。將此三角瓶放入37℃的恒溫水浴中攪拌72 h，取出后靜置。按以上色譜條件測定平衡后的水相中的藥物濃度，記C。

(1)

P為油水分配系數(shù)；C0為水相中藥物初始濃度；C為分配平衡后水相中藥物濃度。

2.3.3葛根素光穩(wěn)定性試驗

精密稱取葛根素原料藥5 mg置于西林瓶中，另配制濃度為20 μg/mL的葛根素甲醇溶液，自然光下放置，分別于0、3、4、6、8 h取樣測定，計算葛根素的百分含量。

2.3.4葛根素熱穩(wěn)定性試驗

精密稱取葛根素原料藥5mg置于西林瓶中，放置在35℃的烘箱中，同時配制濃度為20μg/mL的葛根素甲醇溶液，放置在35℃的恒溫水浴中。分別于5、10、30、60、80、120min取樣測定，計算葛根素的百分含量。

2.4制備工藝的單因素考察

分別對攪拌速度、制備溫度、攪拌時間、超聲時間四個中的一個為變量來做單因素試驗。以包封率為評價指標，依次進行下列四個單因素試驗：攪拌速度(400、600、800rpm)、制備溫度(70、72、75℃)、攪拌時間(5、10、15min)、超聲時間(8、10、12min)。考察各因素的不同水平對葛根素固體脂質(zhì)納米粒的包封率的影響。

2.5正交試驗優(yōu)化工藝

選取影響較為顯著的4個因素，進行L9(34)正交試驗優(yōu)化工藝。

2.6質(zhì)量評價初步研究

2.6.1外觀觀察

室溫條件下，肉眼觀察葛根素固體脂質(zhì)納米粒溶液的外觀。

2.6.2葛根素固體脂質(zhì)納米粒的凍干粉末

以6 %的甘露醇為凍干粉末保護劑，放入冷凍干燥機中，24h后取出立即壓蓋密封，即得葛根素固體脂質(zhì)納米粒凍干粉。

2.6.3穩(wěn)定性考察

按最優(yōu)處方制備3批葛根素固體脂質(zhì)納米粒溶液，葛根素固體脂質(zhì)納米粒溶液分別放置在4 ℃和室溫下放置保存。于1、2、3個月觀察外觀，并分別取樣測定其包封率。

2.6.4包封率及載藥量的測定

取0.5mL葛根素固體脂質(zhì)納米粒溶液置于離心管上端，10000rpm，離心10min，濾液用甲醇定容至10mL，按“2.2.2“”項色譜條件下進樣檢測。另取葛根素固體脂質(zhì)納米粒溶液0.5mL置于10mL容量瓶中，用甲醇超聲，并定容至刻度，離心，按“2.2.2”項色譜條件下進樣檢測，按下列公式計算包封率及載藥量。

(2)

(3)

公式中Wtotal為藥物的加入總量，Wfree為葛根素固體脂質(zhì)納米粒溶液中游離的藥物量，Wlipid為納米粒的總重量。

3實驗結(jié)果

3.1葛根中葛根素的體外分析方法的建立

3.1.1最大吸收波長的測定

葛根素標準品溶液在250nm有最大吸收，見圖1，相應濃度的空白葛根素固體脂質(zhì)納米粒溶液在此處無干擾，見圖2，因此選擇250nm用于檢測葛根中葛根素含量的檢測波長。

圖1葛根素標準品的紫外掃描圖譜

3.1.2專屬性考察

空白葛根素固體脂質(zhì)納米粒溶液、對照品溶液和葛根素固體脂質(zhì)納米粒溶液，色譜見圖3。B、C中葛根素的保留時間分別為8.754 min和8.908 min。

圖2　空白固體脂質(zhì)納米粒的紫外掃描圖譜

3.1.3標準曲線的制備

分別對不同濃度的葛根素標準溶液進樣，繪制標準曲線見圖4。得線性回歸方程：A=26.263C+11.600(r=0.9996)，結(jié)果表明葛根素在16~80μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖4　葛根素的標準曲線

3.1.4精密度試驗

分別計算日內(nèi)及日間精密度，見表1。葛根素標準品溶液的精密度均小于3%，符合方法學要求。

表1　精密度測定結(jié)果(n=5)

3.1.5回收率試驗

回收率計算結(jié)果見表2。此分析方法回收率均小于3 %，符合方法學要求。

表2　回收率測定結(jié)果(n=3)

3.1.6定量限和檢測限的測定

當信號值/基線噪聲值=2～3對應的已知濃度，就是檢測限。當信號值/基線噪聲值=10對應的已知濃度，就是定量限，得到最低檢測限濃度為5ng/mL，最低定量限濃度為10ng/mL。

3.2葛根素基本理化性質(zhì)研究3.2.1溶解性測定

葛根素在甲醇、30 %的乙醇的溶解度依次減弱，在乙醚和無水乙醇中的溶解度大體一樣，見表3。

表3　葛根素在不同溶液中的溶解性

注：+溶解較差，溶解較好，溶解最好。

3.2.2油水分配系數(shù)的測定

當計算出LogP大于零，藥物為脂溶性藥物，結(jié)果表明，葛根素為親脂性藥，見表4。

表4　葛根素的油水分配系數(shù)(n=3)

3.2.3葛根素光穩(wěn)定試驗

通過測定葛根素原料藥及葛根素溶液的百分含量，結(jié)果顯示葛根素對光基本穩(wěn)定，見表5。

表5　葛根素光穩(wěn)定試驗

3.2.4葛根素熱穩(wěn)定性試驗

通過測定葛根素原料藥的百分含量，結(jié)果顯示葛根素對熱基本穩(wěn)定。見表6。

表6　葛根素熱穩(wěn)定試驗

3.3制備工藝的單因素考察

3.3.1攪拌速度對葛根素固體脂質(zhì)納米粒包封率的影響

其他因素保持不變，不同攪拌速度所得包封，見圖5，從圖5可以看出攪拌速度為800rpm時藥物的包封率較其他兩組高。

圖5　攪拌速度對包封率的影響

3.3.2制備溫度對葛根素固體脂質(zhì)納米粒包封率的影響

其他因素保持不變，不同制備溫度所得包封，見圖6，從圖6中可以看出制備溫度為75℃時藥物的包封率較其他兩組高。

圖6　制備溫度對包封率的影響

3.3.3加熱時間對葛根素固體脂質(zhì)納米粒包封率的影響

其他因素保持不變，不同加熱時間所得包封，見圖7，從圖7中可以看出加熱時間為10min時藥物的包封率較其他兩組高。

圖7　加熱時間對包封率的影響

3.3.4超聲時間對葛根素固體脂質(zhì)納米粒包封率的影響

其他因素保持不變，不同超聲時間所得包封，見圖8，從圖8中可以看出超聲時間為10min時藥物的包封率較其他兩組高。

圖8超聲時間對包封率的影響

3.4正交試驗優(yōu)化工藝

本實驗在單因素考察的基礎(chǔ)上，以包封率為考察指標，篩選出影響葛根素固體脂質(zhì)納米粒溶液包封率的四個因素：轉(zhuǎn)數(shù)(A)、加熱溫度(B)、加熱時間(C)、超聲時間(D)。每個因素選取3個水平，因素水平見表7。以包封率為篩選指標，用正交試驗表L9(34)對工藝進行優(yōu)化。正交試驗設計及見表8。

表7　正交試驗的因素水平表

表8　L9(34)正交試驗

由表中極差值R可以看出各因素影響的主次順序為B>D>A>C，說明加熱溫度、超聲時間、攪拌速度、加熱時間對藥物包封率的影響依次減弱。由此可知各因素的最優(yōu)化組合為A3B3C2D3。最佳工藝為：轉(zhuǎn)數(shù)900rpm，加熱溫度78℃，加熱時間10min，超聲時間10min。

3.5質(zhì)量評價研究

3.5.1外觀觀察

室溫下，觀察葛根素固體脂質(zhì)納米粒溶液的外觀比較澄清透明，并伴有藍色乳光。

3.5.2葛根素固體脂質(zhì)納米粒溶液的凍干結(jié)果

以甘露醇為凍干粉末的葛根素固體脂質(zhì)納米粒，外形飽滿，顆粒疏松，表面光滑。

3.5.3穩(wěn)定性觀察結(jié)果

葛根素穩(wěn)定性，見表9。葛根素固體脂質(zhì)納米粒溶液在4℃保存下，微粒較穩(wěn)定；在室溫下保存，微粒變化較大。

表9　葛根素固體脂質(zhì)納米粒溶液及凍干粉

3.5.4包封率及載藥量測定

按"2.6.4"項下測定方法及計算公式得包封率及載藥量，測得的平均包封率為96.43 %，載藥量為1.47 ，見表10。

表10　葛根素固體脂質(zhì)納米粒溶液的包封率

4討論

本實驗建立了體外分析方法，確立了用高效液相色譜法進行葛根素固體脂質(zhì)納米粒的含量測定。采用乳化-超聲分散法制備葛根素固體脂質(zhì)納米粒溶液，從經(jīng)濟學的角度考慮，乳化-超聲分散法操作簡單，可控性較強，質(zhì)量影響因素相對較少[5，6]。 以包封率為評價指標，采用L9(34)正交試驗設計方法表明，最終確定優(yōu)化后的制備工藝為：制備的時候攪拌速度為900rpm，制備溫度為78℃，攪拌時間為10min，超聲時間為10min。將超聲后的葛根素固體脂質(zhì)納米粒溶液過0.45μm濾膜，即可得有藍色乳光的葛根素固體脂質(zhì)納米粒溶液。

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Study on the preparation of puerarin solid lipid nanoparticles

LIUJuan1,GUOYu1,HUMeng-yang2,ZHAIMei-fang1,PINGYang1,ZHANGLing-zhi1,LIXue-xin1,YULian1

(1.College of Pharmacy, Jiamusi University, Jiamusi 154007, China; 2.Department of Clinical Medicine, Shandong University, Jinan 250000, China)

Abstract:Objective: To explore the preparation process of puerarin solid lipid nanoparticles. Methods:Puerarin solid lipid nanoparticles were prepared by using emulsion ultrasonic method. We investigated single factors in the preparation process. The optimum experimental process was filtrated by using orthogonal test.The drug loading of puerarin solid lipid nanoparticles were investigated in the research. Results: The optimum experimental process filtrated by using orthogonal test is that the preparation temperature is 78℃, the heating time is 10min, the stirring speed is 900rpm and the ultrasonic time is 10min. According to the optimum experimental process, the 3 batches of puerarin solid lipid nanoparticles liquor are prepared in the research. The encapsulation rate is 96.43%. The drug loading is 1.47%. Conclusions: Puerarin solid lipid nanoparticles prepared by the selection of technology has preferable clarity, blue opalescence and higher encapsulation rate and drug loading. This method can be used to prepare the puerarin solid lipid nanoparticles.

Key words:puerarin; solid lipid nanoparticles; preparation technology; researc

(收稿日期：2015-11-11)

中圖分類號：R284

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0104(2016)01-0001-05

作者簡介：劉娟(1949~)女，黑龍江佳木斯人，教授，碩士研究生導師。通訊作者：郭宇(1988~)女，黑龍江佳木斯人，在讀碩士研究生。E-mail:Guoyu1988@163.com。

基金項目：①國家自然科學基金項目，編號：81274101。