馬齒莧對戊四氮致癲癇大鼠海馬細胞凋亡和Caspase-3基因表達的影響①

孫維佳，吳慶峰，張曉梅

(1.佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯154003;2.齊齊哈爾醫學院第一附屬醫院，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

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馬齒莧對戊四氮致癲癇大鼠海馬細胞凋亡和Caspase-3基因表達的影響①

孫維佳1,2，吳慶峰1，張曉梅1

(1.佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯154003;2.齊齊哈爾醫學院第一附屬醫院，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

摘要：目的：探索馬齒莧對戊四氮(PTZ)致癇大鼠海馬神經元的保護作用。方法：應用戊四氮隔日腹腔注射制造癲癇慢點燃大鼠模型。將48只Wistar雄性大鼠分成4組：正常對照組、戊四氮組、低劑量馬齒莧組、高劑量馬齒莧組、，每組6只。采用WESTBLOT法檢測Caspase-3檢測大鼠海馬組織內Caspers-3蛋白變化，流式細胞儀檢測細胞凋亡數量變化。結果：PTZ組的神經元凋亡細胞和Caspase-3的表達明顯增多，應用馬齒筧的兩組癲癇大鼠的神經細胞的凋亡受到了抑制，減少了Caspase-3的表達。結論：馬齒莧有保護癲癇大鼠腦組織的作用，且長期大劑量的效果顯著，為了給臨床應用提供理論依據，本實驗通過實驗觀察馬齒莧對戊四氮致癇大鼠海馬神經元的保護作用，探索馬齒筧在改善癲癇方面的應用價值。

關鍵詞：馬齒莧；戊四氮；癲癇；細胞凋亡；Caspers-3

癲癇是慢性反復發作性短暫腦功能失調綜合征，反復癇性發作表現為腦神經元異常放電，引起發作性意識喪失。癲癇持續狀態可導致中樞神經系統急癥及持久性損害，尤其對海馬神經元損傷較大，根據流行病學檢測，我國癲癇患者，一般人群的癲癇年發病率為50~70/10萬，患病率約為5‰[1，2]。其中難治性癲癇的患者約占25%。傳統治療多為西藥，副作用較大，而中藥馬齒莧為馬齒莧科植物馬齒莧的干燥地上部分。性寒，味酸，具有清熱解毒、涼血止血的功效，現代對馬齒莧的藥理作用研究多集中在其抗炎、抗病毒作用方面。近年來隨著研究的深入，對馬齒莧的研究擴展到抗腫瘤、降血脂、增強免疫力、抗氧化等發面，并已經取得了一定的成果[3，4]。本實驗應用PTZ致癇大鼠模型，給予中藥馬齒莧干預，研究馬齒莧對PTZ致癲癇大鼠海馬細胞凋亡和Caspers-3蛋白表達的影響，探求馬齒莧對癲癇大鼠的神經元保護作用。

1材料與方法

1.1實驗材料

①實驗動物準備：健康Wistar雄性大鼠60只，8~10周齡，體重200~250g，購買與齊齊哈爾醫學院動物實驗中心。

②實驗藥物：馬齒莧(購買于齊齊哈爾醫學院第一附屬醫院藥劑科并經鑒定，由安國市藥興藥材有限公司飲片加工廠)使用下述方法制備成濃度分別為g/mL的水煎醇提液：(1)用10倍體積的蒸餾水中浸泡生藥2h，(2)加熱至沸騰后，再用小火煎1h，過濾后收集；(3)再加入10倍體積的蒸餾水，沸騰后小火煎1h，過濾后收集濾液。(4)重復步驟(3)；(5)混合(2)、(3)過濾液，再濃縮至濃度100%的中藥液，過濾后收集；(6)使用磁力攪拌器邊攪邊加入3倍量無水乙醇，持續攪拌，放置24h；(7)過濾，用離心機2000rpm/min離心30min，吸取上清液；(8)上清液將無水乙醇全部揮發，從而制成濃度為g/mL的溶液；(9)高溫高壓滅菌，分裝后放置4℃保溫箱保存。計算實驗動物給藥劑量，按體重計算，成人馬齒莧1日劑量為80g(人的標準體重按60kg算)，鼠的一日等效劑量約為6.25×人的1日劑量，低、高劑量分別是等效劑量的0.5、2倍，如上述方法計算出大鼠的馬齒莧給藥低、高劑量分別3.50g/kg·d、13.93g/kg·d，而制成水煎劑濃度分別為 40%、160%，無菌分裝4℃保存備用。

③制作動物模型：將大鼠隨機分為5組，每組10只。空白組：隔日腹腔注射生理鹽水 3.5mL/kg, 共13次。PTZ組：隔日腹腔注射35mg/kg戊四氮，共13次，每日提前30min給予0.9%生理鹽水3.5mL/kg腹腔注射。

低劑量馬齒莧組：除隔日腹腔注射戊四氮外，且每日提前30min給予馬齒莧3.50g/kg·d腹腔注射。

高劑量馬齒莧組：除隔日腹腔注射戊四氮外，每日提前30min給予馬齒莧13.93g/kg·d腹腔注射。

④癲癇級別評價：按Racine分級方法分為5級觀察大鼠行為變化：0級：無驚厥；Ⅰ級：面肌痙攣，如同濕狗似抖動，Ⅱ級：面、頸部痙攣，表現為點頭扭頭等；Ⅲ級：一側前肢陣攣，面部痙攣及節律性點頭；Ⅳ級：面部、頸部痙攣、雙側前肢陣攣伴后肢站立；Ⅴ級：全身陣攣失去平衡跌倒、面部痙攣、節律性點頭、前肢陣攣、后肢站立。戊四氮藥物注射后各組大鼠逐漸出現癲癇癥狀，最初呈Ⅱ級發作，且時間短，為癲癇潛伏期。注射結束后到出現Ⅴ級發作時間的癲癇大發作持續時間為1h，出現Ⅴ級大發作，慢點燃模型制備成功，實驗過程中戊四氮組大鼠死亡3只,低劑量馬齒莧組死亡1只。

1.2方法

①標本取材：動物藥物注射實驗全部結束24h后，給與10%水合氯醛按體重腹腔注射麻醉，斷頭處死大鼠，取腦組織，在低溫冰塊上分離出雙側海馬組織，取大鼠右側海馬組織PBS液沖洗，分離，流式細胞儀測定凋亡細胞。大鼠左側海馬組織剪碎，按7倍體積加入總蛋白提取液，如樣本40mg配制280μL蛋白提取液。組織使用超聲勻漿粉碎，在4℃下放置1h，使用12000rpm 離心30min，吸取上清液，用BCA試劑盒檢測標本的蛋白濃度，分裝后用-80℃凍存，備用。

② 流式細胞儀檢測凋亡細胞：大鼠右側海馬組織細胞離心沉淀3~5min，加入PBS液，離心沉淀細胞；稀釋；調節其濃度；將細胞懸液加入PI溶液；混勻后孵育15min，在反應管中加入PBS液，流式細胞儀(FACS)測定凋亡細胞。

③ WESTBLOT法檢測caspase-3：制備不連續SDS-PAGE。取各組總蛋白40μg，蛋白樣品中加入SDS-PAGE，煮沸7min，使蛋白變性，冷卻后，跑膠。準備轉膜，漂洗蛋白膜2min，4℃封閉過夜，4℃孵育過夜，用TPBS液洗膜5次，每次5min，同時加入羊抗免 IgG 熒光抗體和羊抗鼠 IgG 熒光抗體( 1：3000，封閉液稀釋)，37℃孵育1h，TPBS 洗膜4次，每次 5min，PBS液洗膜5min。Odyssey遠紅外熒光掃描成像系統掃描，后測定目標帶單位密度，Caspers-3的相對密度用β-actin做為參照。

1.3統計學方法

采用SPSS13.0進行處理，P<0.05認為有統計學意義。

2結果

2.1凋亡細胞率

空白組腦組織海馬區的細胞凋亡率最低，僅可見到的少量凋亡細胞，0.093±0.007，PTZ組凋亡細胞率最高為0.435±0.033，PTZ組+低馬齒莧組凋亡細胞率為0.227±0.02。PTZ+高馬齒莧組凋亡細胞率為0.165±0.014，各組間區域比較經過t檢驗(P<0.05)。見表1。

表1　凋亡陽性細胞計數凋亡率 ±s)

各組間區域比較經過t檢驗，為差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.2Caspase-3蛋白表達

Caspase-3蛋白：空白組0.28±0.02；PTZ=0.54±0.03；低馬齒莧組0.35±0.03; 高馬齒莧組0.30±0.01。PTZ癲癇組大鼠與正常空白對照組相比，Caspase-3蛋白水平明顯升高(P<0.05)；馬齒莧干預后可顯著降低Caspase-3蛋白水平(P<0.05)；低馬齒莧組及高馬齒莧組無明顯統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2　Caspse-3定量檢測比較

各組間區域比較經過t檢驗，為差異具有統計學意義(P<0.05)。

3討論

全世界約有五千萬的癲癇患者，患者數量眾多，癲癇病是一種以反復癇性發作為特征的慢性疾病[5]，癲癇的藥物治療一旦開始服藥，大多數要長期用藥，直到癲癇得以控制，如患者及家屬隨意停用藥物或減量，可能導致病情加重，甚至出現持續癲癇狀態，然而癲癇藥物的不良反應也應重視，服用一些治療癲癇的西藥例如卡馬西平、苯巴比妥、托吡酯等藥物會出現肝腎損傷，行為異常、周圍神經損害、情緒等異常，認知功能受損；眩暈嗜睡、感覺異常、皮疹等等，中藥馬齒莧副作用小、價格低廉、采集方便等優點，藥理作用研究多在抗病毒、抗炎、抗腫瘤、降血脂、增強免疫力抗氧化等[6，7]，但對癲癇治療，腦保護未見研究，本實驗研究結果發現，PTZ組的神經元凋亡細胞和Caspase-3的表達明顯增多，而應用馬齒莧干預后的兩組癲癇大鼠的神經細胞的凋亡受到了抑制，減少了Caspase-3的表達，并且高劑量的馬齒莧效果更好，從而證明了馬齒莧可以治療癲癇，減少腦組織損傷的機制與抗神經元細胞凋亡有關，其抗凋亡的機制是通過對Caspase-3蛋白基因的調控來表達實現的，但這種調控的分子機制及其是否有其它調控機制還需要下一步的研究，本實驗為尋求難治性癲癇提供新途徑。

參考文獻：

[1]Coulter DA, Mclntyre DC, Loscher W. Animal models of limbi epilepsies:what can they tell us[J].Brain Pathol, 2002, 12: 240-256

[2]LoscherW. Animal models of intractable epilepsy[J].Prog Neurobiol, 1997,53:239-258

[3]Bmnghton B R，Reutens D C，Sobey C G. A poptotie mechanism s after cerebral isehemia[J].Strob, 2009, 40 (5):331-339

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[5]欒倩,劉蕾,劉君星.靈芝酸對癇樣放電海馬神經元ERK1/2磷酸化水平的影響[J].黑龍江醫藥科學，2014，37(2):1-3

[6]王影，聶磊，張巖，等.左乙拉西坦對癲癇大鼠認知功能及海馬組織中NPY和NCAM-mRNA表達的影響[J].黑龍江醫藥科學，2013，36(3)：3-5

[7]張巖，王海燕.左乙拉西坦對癲癇大鼠認知功能的影響研究[J].黑龍江醫藥科學， 2013，36(2)：6-8

(收稿日期：2015-01-10)

中圖分類號：R742.1

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0104(2016)01-0053-02

作者簡介：孫維佳(1981～)女，黑龍江五大連池人，在讀碩士研究生，主治醫師。通訊作者：張曉梅(1969～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫師，教授,碩士研究生導師。E-mail:sjkx2727@163.com。

基金項目：黑龍江省教育廳科研項目，編號：12521543。