人參皂苷Rg3聯合索拉非尼對人肝癌細胞株侵襲與轉移的影響

陸玲玲

(遼寧醫學院附屬第一醫院，遼寧　錦州　121000)

?

人參皂苷Rg3聯合索拉非尼對人肝癌細胞株侵襲與轉移的影響

陸玲玲

(遼寧醫學院附屬第一醫院，遼寧錦州121000)

〔摘要〕目的探討人參皂苷Rg3聯合索拉非尼對人肝癌細胞株侵襲與轉移的影響。方法分別將人參皂甙Rg3和索拉非尼兩種單藥、兩藥聯合方式作用于人肝癌細胞，觀察其對細胞侵襲和轉移的影響。結果作用1 h，索拉非尼組黏附抑制率顯著高于人參皂苷Rg3組(P<0.05或<0.01)，聯合組顯著高于索拉非尼組和人參皂苷Rg3組(P<0.01)；作用2 h，人參皂苷Rg3組抑制率顯著高于索拉非尼組(P<0.01)，并且高于人參皂苷Rg3組作用1 h(P<0.01)；兩藥聯合對肝癌細胞的黏附抑制率具有協同作用(Q=2.63>1.15)。索拉非尼單藥及索拉非尼聯合人參皂苷Rg3對肝癌細胞的遷移抑制率均顯著高于人參皂苷Rg3單藥作用(P<0.01)，并且兩藥聯合的抑制率顯著高于索拉非尼單藥組(P<0.01)；兩藥聯合對肝癌細胞的遷移抑制作用具有協同作用(Q=1.46>1.15)。索拉非尼組和聯合組侵襲抑制率均顯著高于人參皂苷Rg3組(P<0.01)，兩藥聯合對肝癌細胞的侵襲抑制作用具有拮抗作用(Q=0.71<0.85)。與陰性對照組比較，人參皂苷Rg3組CD44V6、基質金屬蛋白酶(MMP)-9表達水平顯著下降，索拉非尼組和聯合組血管內皮生長因子(VEGF)-C、CD44V6及MMP-9表達均顯著下降(P<0.05)；與人參皂苷Rg3組比較，聯合組VEGF-C及CD44V6水平顯著下降；與索拉非尼組比較，聯合組VEGF-C水平顯著下降(P<0.05)。結論人參皂苷Rg3、索拉非尼單藥及兩藥聯合對肝癌細胞SMMC-7721細胞株的黏附、遷移、侵襲具有一定的抑制作用，對細胞的黏附和遷移抑制作用兩者均具有協同作用。

〔關鍵詞〕人參皂苷Rg3；索拉非尼；肝癌細胞；侵襲；轉移

腫瘤的侵襲和轉移過程復雜，黏附、降解、運動、新生血管形成等參與了腫瘤細胞的轉移和侵襲。肝細胞癌是臨床常見腫瘤，并且根治性切除后具有較高的復發率，而局部治療的轉移和復發率更高。人參皂苷Rg3對腫瘤細胞有抑制作用，可通過抑制腫瘤新血管生成抑制腫瘤細胞的侵襲、轉移和復發〔1，2〕。索拉非尼是一種新型的多靶向抗癌藥物，選擇性作用于一些蛋白的受體，而這些蛋白受體在腫瘤細胞的生長過程中發揮分子開關樣作用〔3，4〕。本研究主要研究人參皂苷Rg3聯合索拉非尼對人肝癌細胞株侵襲與轉移的影響。

1材料與方法

1.1材料及試劑試驗細胞為人肝癌SMMC-7721細胞株，由上海細胞生物研究所提供。人參皂苷Rg3由上海撫生生物科技有限公司提供。索拉非尼(德國Bayer Schering pharma AG，批號：201304211)。培養基、胎牛血清由環凱微生物科技提供。CD44V6兔抗人多克隆抗體、血管內皮生長因子(VEGF)-C兔抗人多克隆抗體、基質金屬蛋白酶(MMP)-9兔抗人多克隆抗體由上海紫域生物科技有限公司提供。CO2培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；自動酶標讀數儀：深圳市愛康生物科技有限公司；高速冷凍離心機：北京時代北利離心機有限公司。

1.2細胞培養肝癌細胞株接種于培養瓶后，加培養液，放入37℃，5%CO2，飽和濕度的培養箱培養。覆蓋瓶底的80%后開始傳代，取對數生長期的細胞用于研究。

1.3分組方法根據作用藥物的不同，分為人參皂苷Rg3組、索拉非尼組、聯合組及陰性對照組。參考文獻〔5〕選擇藥物濃度為對肝癌細胞株24 h增殖抑制率<15%，人參皂苷Rg3濃度7.5 μg/ml，索拉非尼濃度1.25 μmol/L。

1.4MTT比色法檢測各組細胞黏附實驗對數生長的肝癌細胞株接種于培養瓶中，細胞濃度3×104個/ml，培養瓶含等量的培養液。放置于培養箱內培養，培養條件37℃，5%CO2，24 h后根據設定的分組，加入相應的藥物，陰性對照組加培養液。放置培養箱內培養24 h，培養條件37℃，5%CO2。包被基底膜，加入96孔板，每孔30 μl，4℃過夜，水化基地膜。消化藥物處理后的接種細胞，培養液調整細胞密度為2×105個/ml，接種于包被基底膜的96孔板內，100 μl/孔，每組設5個復孔，結果取平均值。培養板置于培養箱內分別培養1和2 h，培養條件37℃，5%CO2。采用MTT比色法檢測黏附情況。培養后1和2 h，棄上清，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，加20 μl的濃度為5 mg/ml的MTT，繼續培養4 h，棄上清，加100 μl的鹽酸異丙醇，混勻。在波長570 nm處讀吸光度值。計算黏附抑制率=〔1-(實驗組吸光度值-空白孔吸光度值)〕/(陰性對照組吸光度值-空白孔吸光度值)×100%。

1.5Transwell小室實驗檢測各組細胞遷移情況采用Transwell小室實驗計算各組遷移率。對數生長期細胞去除含有血清的培養液，換為無血清培養液培養12 h，調整細胞密度為1.0×105個/ml，取100 μl加入Transwell小室，加入對應的藥物，對照組加培養液，均為100 μl，每組設5個復孔，結果取平均值。Transwell小室的下室加入含20%胎牛血清的培養液500 μl，放置于培養箱中培養24 h，培養條件37℃，5%CO2。24 h后取出，擦去未遷移的細胞，結晶紫染色，PBS沖洗。在顯微鏡下計數小室外底部細胞數，每個樣本去3個視野取平均數為發生遷移的細胞數，計算遷移抑制率。遷移抑制率=〔1-(實驗組穿膜細胞數/對照組的穿膜細胞數)〕×100%。

1.6Transwell小室實驗檢測各組細胞侵襲實驗對數生長細胞去除含有血清的培養液，換為無血清培養液培養12 h。將融化稀釋的Matrigel基質膠30 μl加入Transwell小室，37℃孵育2 h；取50 μl濃度為10 mg/L纖維連接蛋白溶液包被小室反面，風干。調整細胞密度為1×105個/ml，取100 μl加入小室，加相應的藥物100 μl，對照組加培養液，每組設5個復孔。小室下室加含20%胎牛血清的培養液500 μl。培養24 h，培養條件37℃，5%CO2。取出小室，擦去上室未遷移細胞，風干，結晶紫染色，PBS沖洗。顯微鏡下計數細胞，每個樣本取3個視野，計數侵襲細胞數，計算侵襲抑制率。抑制率=〔1-(實驗組侵襲細胞數/對照組侵襲細胞數)〕×100%。

1.7采用免疫細胞化學法檢測VEGF-C、CD44V6、MMP-9蛋白表達調整細胞密度為3×104個/ml。1.5 ml細胞懸液計入6孔板，培養24 h，培養條件37℃，5%CO2。加對應藥物1.5 ml，對照組加培養液1.5 ml，培養48 h，培養條件37℃，5%CO2。棄上清，固定細胞，將細胞爬片加PBS覆蓋，15 min后PBS沖洗3次，加0.1%的triton-100，放置15 min，PBS浸泡5 min，沖洗3次，加3%H2O2-甲醇溶液浸泡10 min，PBS沖洗3次，加一抗，4℃過夜，PBS沖洗3次，加增強劑孵育20 min，PBS沖洗3次，加二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，DAB顯色。染色成功后終止染色。加蘇木素復染30 min，蒸餾水沖洗，封片。CD44V6定位于細胞膜上，呈棕黃色，也可見細胞質內，MMP-9和VEGF-C定位于細胞質，呈棕黃色。在200倍視野下取細胞分布均勻視野10個，根據著色強度計分：無0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕色3分。計算HSCORE得分。HSCORE=∑Pi(i+1)，i為計分，Pi為得分為i的比例。

1.8兩藥聯合作用判斷Q=聯合抑制率/〔人參皂苷Rg3單藥抑制率+(1-人參皂苷Rg3單藥抑制率)×索拉非尼單藥抑制率〕，Q>1.15為協同作用，<0.85為相互拮抗作用，0.85~1.15為相加作用。

1.9統計學方法采用SPSS15.0統計學軟件進行F檢驗，t檢驗。

2結果

2.1各組黏附抑制率比較作用1 h，索拉非尼組黏附抑制率顯著高于人參皂苷Rg3組(P<0.05)，聯合組顯著高于索拉非尼組和人參皂苷Rg3組(P<0.01)；作用2 h，人參皂苷Rg3組抑制率顯著高于索拉非尼組(P<0.01)；并且高于人參皂苷Rg3組作用1 h(P<0.01)。見表1。兩種藥物聯合作用1 h Q=2.63，>1.15，說明兩藥聯合對肝癌細胞的黏附抑制率具有協同作用。

表1　各組黏附抑制率、遷移抑制率、侵襲抑制率比較±s)

與人參皂苷Rg3組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與索拉非尼組比較：3)P<0.05

2.2各組遷移抑制率比較索拉非尼單藥及索拉非尼聯合人參皂苷Rg3對肝癌細胞的遷移抑制率均顯著高于人參皂苷Rg3單藥作用(P<0.01)，并且兩藥聯合的抑制率顯著高于索拉非尼單藥(P<0.01)。見表2。Q=1.46>1.15，提示兩藥聯合對肝癌細胞的遷移抑制作用具有協同作用。見表1。

2.3各組侵襲抑制率比較索拉非尼組和聯合組侵襲抑制率均顯著高于人參皂苷Rg3組(P<0.01)。見表1。Q=0.710，<0.85，提示兩者聯合對肝癌細胞侵襲抑制作用具有拮抗作用。

2.4各組VEGF-C、CD44V6、MMP-9蛋白表達HSCORE評分與陰性對照組比較，人參皂苷Rg3組CD44V6、MMP-9表達水平顯著下降，索拉非尼組和聯合組VEGF-C、CD44V6及MMP-9表達均顯著下降(P<0.05)；與人參皂苷Rg3組比較，聯合組VEGF-C及CD44V6水平顯著下降；與索拉非尼組比較，聯合組VEGF-C水平顯著下降(P<0.05)。見表2。

表2　各組VEGF-C、CD44V6、MMP-9蛋白表達

與陰性對照組比較：1)P<0.05；與人參皂苷Rg3組比較：2)P<0.05；與索拉非尼組比較：3)P<0.05

3討論

近年來中醫中藥的抗癌作用以其副作用小、作用溫和等優點逐漸受到關注。人參皂苷 Rg3是人參中的有效活性成分，具有抗腫瘤的作用。索拉非尼是一種新型的多靶向治療的抗腫瘤藥物。

本研究中，人參皂苷 Rg3和索拉非尼對肝癌細胞的黏附均具有一定的抑制作用。人參皂苷Rg3在2 h時的抑制率顯著高于1 h的抑制率，而索拉非尼抗黏附作用的時間依賴性不明顯，具體原因期望在今后的研究中進一步明確。人參皂苷Rg3能夠促進NO產生，誘導細胞的凋亡，其次能夠抑制癌癥細胞對細胞外基質的黏附作用，抑制腫瘤新生血管的形成，并降低細胞內的Ca2+〔6，7〕。本次研究結果顯示，人參皂苷Rg3對肝癌細胞的黏附抑制作用相對較為溫和，單藥使用時作用相對較弱，而聯合索拉非尼能夠顯著增加抑制率，并且兩者有協同作用。

Transwell小室遷移實驗是計數穿膜細胞個數，定量計算藥物對細胞的遷移能力的影響。本研究顯示索拉非尼和人參皂苷Rg3聯合對肝癌細胞侵襲的抑制作用具有一定拮抗作用。

原發性肝癌侵襲過程中有多種黏附分子參與其中。CD44是一種細胞膜跨膜蛋白，也是一種黏附分子，CD44V6(CD44基因含v6外顯子的變異體)，其變異部分位于細胞外，對黏附作用有顯著的影響，介導轉移，參與細胞與細胞，細胞與基質之間的黏附，與肝癌細胞血管浸潤具有密切的關系〔8，9〕。MMP-9屬于MMPs家族成員。MMPs在肝癌細胞浸潤和轉移過程及新生血管形成過程中發揮降解基質的作用，能夠降解幾乎所有的血管基底膜及細胞外基質〔10，11〕。另外其還具有升高血管生長因子的作用，調節細胞生長、促進血管生成，這些均在肝癌細胞的轉移和侵襲過程中發揮重要作用。MMP-9主要降解破壞細胞外基質中Ⅳ型和Ⅴ型膠原及透明質酸〔12，13〕。VEGF在腫瘤生長和轉移過程中的血管生成過程中具有重要的促進作用，是內皮細胞特異性有絲分裂原，能夠誘導血管形成及血管的通透性〔14，15〕。在早期，其還能夠誘導內皮細胞生成MMPs和組織因子，間接激活明膠酶原A降解基膜，從而促進細胞增殖。目前已知新生血管的生成是抗腫瘤治療的重要的靶點之一。

綜上，人參皂苷Rg3、索拉非尼單藥及兩藥聯合對肝癌細胞SMMC-7721細胞株的黏附、遷移、侵襲具有一定的抑制作用，對細胞的黏附和遷移抑制作用兩者均具有協同作用，而其對肝癌細胞遷移、侵襲的抑制作用可能與降低細胞VEGF-C、CD44V6、MMP-9蛋白表達水平有關。

4參考文獻

1Liu TG，Huang Y，Cui DD，etal.Inhibitory effect of ginsenoside Rg3 combined with gemcitabine on angiogenesis and growth of lung cancer in mice〔J〕.BMC Cancer，2009；9(1)：250.

2Chen XP，Qian LL，Jiang H，etal.Ginsenoside Rg3 inhibits CX-CR4 expression and related migrations in a breast cancer cell line〔J〕.Int J Clin Oncol，2011；16(5)：519.

3周仁貴，周錫建，李相勇，等.索拉非尼聯合化療栓塞治療晚期原發性肝癌的療效分析〔J〕.現代生物醫學進展，2014；14(13)：2494-6.

4楊明，羅克品，謝岳云，等.肝動脈化療栓塞聯合索拉非尼治療中晚期肝細胞癌〔J〕.肝膽胰外科雜志，2013；25(4)：265-8.

5汪增秀.人參皂苷Rg3、索拉非尼、奧沙利鉑不同聯合方案抗人肝癌細胞株〔D〕.南京：南京醫科大學，2012：10.

6戴小軍，王維民，羅玉妍，等.人參皂苷免疫納米對裸鼠人胃癌NUGC-4組織中血管內皮生長因子D表達的影響〔J〕.江蘇中醫藥，2014;46(8)：76-8.

7董莉真，吳志敏，朱澤，等.人參皂苷Rg3調控ERK通路抑制Lewis小鼠肺癌生長的研究〔J〕.天津醫科大學學報，2014;20(4)：271-4.

8王永輝，毛衛波，樓建，等.胃癌組織中CD44V6、p-Src、Ki67表達及其相關性〔J〕.溫州醫學院學報，2014;44(4)：272-7.

9Bourguignon LY，Wong G，Earle C，etal.Hyaluronan-CD44 interaction promotes c-Src-mediated twist signaling，microRNA-10b expression and RhoA/RhoC up-regulation，leading to Rho-kinase-associated cytoskeleton activation and breast tumor cell invasion〔J〕.J Biol Chem，2010;285 (47)：36721-35.

10德樂黑巴特爾，郭立娜.MMP-9及其與惡性腫瘤關聯的研究進展〔J〕.內蒙古醫學雜志，2014;25(6)：696-8.

11邵杰.人參皂苷Rg3及其與奧沙利鉑和索拉非尼聯合誘導肝癌細胞凋亡的實驗研究〔D〕.南京：南京中醫藥大學，2012：12.

12Malla N，Berg E，Uhlin-Hansen L，etal.Interaction of promatrix metalloproteinase-9/proteoglycan heteromer with gelatin and collagen〔J〕.J Biol Chem，2008;283(20)：13652-65.

13華瓊，華海清，楊愛珍，等.奧沙利鉑和人參皂苷Rg3不同聯合方式對人肝癌細胞株SMMC-7721作用的影響〔J〕.臨床腫瘤學雜志，2013;18(2)：102-7.

14甘世新，姚景春，喬飛飛.頭頸部鱗癌患者血清血管內皮生長因子和人表皮生長因子受體-2水平的檢測及臨床意義〔J〕.山西醫藥雜志，2014;43(9)：997-9.

15許金鵬，張慧慧，李朝品，等.原卟啉鈉體外對人肝癌細胞株SMMC-7721細胞的抑制作用〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2011;17(18)：173-8.

〔2014-11-21修回〕

(編輯苑云杰)

〔中圖分類號〕R73

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)05-1067-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.020

第一作者：陸玲玲(1985-)，女，碩士，住院醫師，主要從事免疫性疾病研究。