眼鏡蛇神經毒素急性毒性試驗*

吳　寧， 張金娟， 熊　英， 肖　俊， 楊　勤

(1.貴州醫科大學 生化與分子生物學教研室， 貴州 貴陽　550025； 2.貴州醫科大學 機能實驗室， 貴州 貴陽　550025； 3.貴州醫科大學 物理教研室， 貴州 貴陽　550025； 4.貴州醫科大學 病理生理學教研室， 貴州 貴陽　550025)

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眼鏡蛇神經毒素急性毒性試驗*

吳寧1， 張金娟2*， 熊英2， 肖俊3， 楊勤4

(1.貴州醫科大學 生化與分子生物學教研室， 貴州 貴陽550025； 2.貴州醫科大學 機能實驗室， 貴州 貴陽550025； 3.貴州醫科大學 物理教研室， 貴州 貴陽550025； 4.貴州醫科大學 病理生理學教研室， 貴州 貴陽550025)

[摘要]目的： 觀察眼鏡蛇毒神經毒素(科博肽注射液)的急性毒性，為藥物的臨床安全使用提供依據。方法：選取3個批次的眼鏡蛇毒神經毒素(樣品1、2、3)，通過預實驗設計各樣品組數和劑量，分別給每組小鼠一次性肌肉注射相應批次和劑量的眼鏡蛇毒神經毒素，觀察給藥后14 d內各受試小鼠的反應、死亡情況及主要臟器有無明顯病理改變；Bliss法計算出各樣品的半數致死量(LD50)及其95%可信限。結果：小鼠肌肉注射眼鏡蛇毒神經毒素注射液后，部分小鼠從出現右后肢(給藥側)跛行，逐漸發展至全身肌張力降低，出現呼吸減慢，最后死亡，部分小鼠癥狀持續約2～6 h后開始緩解并逐漸恢復正常，尸檢結果顯示各臟器肉眼觀察均未見明顯異常；3個批次的眼鏡蛇毒神經毒素經LD50及其95%的可信限分別為：樣品1 LD50為202.097 μg/kg，95%的可信限為174.358～234.249 μg/kg；樣品2 LD50為146.425 μg/kg，95%的可信限為132.904～161.322μg/kg；樣品3 LD50為160.726 μg/kg，95%的可信限為138.863～186.030 μg/kg。結論：眼鏡蛇毒神經毒素注射液具有一定急性毒性，且其毒性作用可能主要累及肌肉神經系統。

[關鍵詞]眼鏡蛇神經毒素類； 急性毒性試驗； 小鼠； 注射，肌肉內； 半數致死量

眼鏡蛇毒神經毒素是一種非麻醉性鎮痛劑[1]，具有不成癮、不產生耐受、鎮痛作用強、療效持久等優點, 對慢性特別是持續性、頑固性疼痛有獨特療效，臨床上用于慢性、頑固性疼痛及晚期癌癥疼痛的治療, 療效確切[2]。本研究采用的科博肽注射液主要成分為眼鏡蛇毒神經毒素，該毒素為眼鏡蛇毒的主要成分之一，是眼鏡蛇毒中最主要的致死成分[3]。本研究選取3個批次的科博肽注射液進行小鼠急性毒性試驗，為眼鏡蛇毒神經毒素的臨床安全應用提供實驗依據。

1材料與方法

1.1藥物試劑與動物

眼鏡蛇毒神經毒素(科博肽注射液)，批號分別為：20110101(簡稱樣品1)、20110601(簡稱樣品2)及20110602(簡稱樣品3)，規格均為2 mL:70 μg(云南南詔藥業提供)。置于4 ℃冰箱中保存，使用前臨時用0.9% NaCl注射液配制。健康昆明種小鼠，體質量18～22g，雌雄各半(購于重慶滕鑫生物技術有限公司，動物合格證號SCXK(渝)2007-005)；小鼠雌雄分籠飼養， 5只/籠。動物室光照充足，通風良好，環境溫度為18～25 ℃，相對濕度為50%～70%，按常規定期消毒；動物適應性飼養3 d后，用于實驗。

1.2方法

1.3觀察指標

給藥后，觀察14 d內動物所發生的異常反應及死亡情況，并將死亡動物及時進行解剖，肉眼觀察各主要臟器有無明顯病理改變，未死亡動物于兩周后處死進行尸檢，觀察主要臟器有無病理改變。

1.4統計學方法

將各樣品組數、各組劑量、各組動物數和各組死亡動物數輸入Bliss統計軟件包中，按Bliss法計算出各樣品的半數致死量(LD50)及95%可信限。各樣品死亡雌雄動物數采用卡方檢驗進行比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

對照組小鼠給藥后表現正常。3個樣品各劑量組動物給藥后約15 min內活動自如，少數動物有舔舐注射部位現象。自給藥后15 min起，有小鼠陸續出現異常表現并進行性加重，最后部分動物死亡，而部分動物能重新恢復正常。小鼠從出現異常表現到死亡的發展過程為：首先出現右后肢(給藥側)跛行，然后表現為活動減少、雙后肢無力、行走時雙后肢向后拖，隨后發展至全身肌張力降低，俯臥于籠中、腹部貼地，腹式呼吸，翻正反射消失，繼而逐漸出現呼吸減慢，進而進一步出現嘆息樣呼吸，最后死亡。部分動物死亡時眼球明顯外凸。若反應過程中未出現呼吸顯著減慢的動物，在癥狀持續約2～6 h后開始緩解并逐漸恢復正常。給藥后，在30 min左右開始有動物死亡，6 h后未記錄到動物死亡，各樣品死亡動物與其性別無關。死亡小鼠尸檢時肉眼未見心、肝、脾、肺、腎、腦等臟器出現明顯異常改變。所有給藥后存活的小鼠在給藥24 h后表現完全正常，其毛皮光滑，飲食、大小便正常，眼、口、鼻未見異常分泌物，黏膜無明顯充血、水腫等表現。體重增長與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。觀察14 d后，處死存活小鼠，對心、肝、脾、肺、腎、腦、胃及腸等主要臟器進行大體解剖學觀察，均未發現所檢器官出現腫脹、囊腫、萎縮、出血、水腫、顏色異常、粘連、硬化等異常改變，與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。3個樣品的LD50及95%的可信限。見表1。

表1　眼鏡蛇神經毒素經肌肉注射后小鼠死亡、LD50與95%可信限

3討論

LD50的測定是一種經典的急性毒性試驗方法。LD50測定的方法有多種，其中Bliss法具有嚴謹精確、考慮周密、適應性強等特點，被認為是最正規的方法[10]，雖然該方法非常繁復，但由于有相應計算機軟件的出現，計算過程復雜已不再是問題。

本試驗采用Bliss法對眼鏡蛇毒神經毒素注射液3個樣品的LD50及其95%可信限進行了測定，根據各樣品不同劑量組小鼠的死亡情況計算出各樣品的LD50分別為202.097 μg/kg、146.425 μg/kg及160.726 μg/kg； 95%的可信限分別為174.358～234.249 μg/kg、132.904～161.322μg/kg及138.863～186.030 μg/kg。而從給藥后小鼠的反應來看，給藥后15 min左右開始出現肌注給藥側肢體的跛行，進行性加重，至出現全身肌張力降低的過程考慮主要是給藥后小鼠的神經肌肉系統受累的過程。小鼠給藥側肢體肌肉張力降低使該側肢體出現跛行，然后是雙后肢肌張力降低致雙后肢無力。再逐漸發展至全身肌肉張力降低，肌張力降低使小鼠無力維持機體站立姿勢，表現為俯臥位，且腹部貼地。當累及到肋間肌，使小鼠不能完成正常

的胸式呼吸，而表現為腹式呼吸。此時作翻正反射檢查，動物無力將身體翻轉，故翻正反射消失。若呼吸肌嚴重受累，致呼吸顯著減慢甚至停止，則機體缺氧而死亡。對死亡小鼠進行解剖，肉眼未見心、肝、脾、肺、腎、腦等臟器出現明顯異常改變。故推測該藥的毒性作用主要累及肌肉神經系統。

綜上所述，本研究測定了3個批次的科博肽注射液的LD50，并根據試驗中小鼠的反應情況推測出該藥的毒性作用可能主要累及肌肉神經系統，為眼鏡蛇毒神經毒素臨床安全用藥及進一步研究提供了依據。

4參考文獻

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[2]朱天新,袁彩君,李曉紅.科博肽與三種藥物配伍使用的實驗研究.中國現代應用藥學雜志, 2007 (5):415-418.

[3]王重洋,顏培鋼.眼鏡蛇神經毒素藥理作用實驗研究進展.亞太傳統醫藥, 2009:165-167.

[4]張金娟，熊英，李瑋，等.了哥王生品及X種炮制品的急性毒性比較研究.中國中藥雜志， 2011(9):1172-1174.

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[6]姜草.甲磺酸普立地諾注射液的臨床前研究.西南大學， 2014.

[7]周俊峰，田淑琴.復方龍瞿提取液的安全性研究.西南民族大學學報， 2009(5)：532-535.

[8]沈杰.卡方檢驗在調研結果分析中的應用.科學大眾：科學教育， 2012(8)：856-859.

[9]黃曉潔,邢成鋒,魏剛.β-細辛醚對小鼠急性毒性作用的初步研究.山東醫藥, 2013(1):26-28.

[10]陳奇.中藥藥理研究方法學 .北京：人民衛生出版社， 1993：112-113.

(2015-07-29收稿，2015-10-11修回)

中文編輯： 吳昌學； 英文編輯： 趙毅

Study on Acute Toxicity of Kebotai Neurotoxin

WU Ning1, ZHANG Jinjuan2, XIONG Ying2, XIAO Jun3, YANG Qin4

(1.ChemistryandBiochemistryLaboratory,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,Guizhou,China; 2.MedicalFunction

Laboratory,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,Guizhou,China; 3.DepartmentofPhysics,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,Guizhou,China; 4.DepartmentofPathophysiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the acute toxicity of kebotai neurotoxin in order to provide guidance for clinical application of medicine. Methods: Mice were given 3 different batches of kebotai to test minimum total dead dose (Dm) and maximum total undead dose (Dn) for grouping and designing doses. 180 Kunming mouse were used in formal experiments. According to the designed groups in pre-examination, 10 mice in each group were given disposable intramuscular injection of kebotai neurotoxin with corresponding batches and doses. Reaction and death conditions of mice within 14 days after injection were observed. Dead mice were dissected and pathological changes of major organs were observed by naked eyes. The number of dead mice in each group were calculated, Bliss method was used to calculate lethal median dose (LD50) and 95% confidence limits of samples. Results： After injection, right hind led (medication leg) lameness happened in some animals, then developed to whole body muscular tension decreased, breathing slow, and died; right hind led lameness appeared in some animals, then develop to whole body muscular tension decreased, in contrast, bradypnea were not observed, animals recovered after 2 to 6 hours. LD50 of 3 batches of kebotai injection samples were as follows: 202.097 μg/kg，146.425 μg/kg and 160.726 μg/kg；and the 95% confidence limits were 174.358～234.249 μg/kg，132.904～161.322 μg/kg and 138.863～186.030 μg/kg. Conclusion: Kebotai injection has a certain toxicity, and muscle and nerve system may be mainly involved in.

[Key words]cobra neurotoxins; acute toxicity tests; mice; injection, intramuscular; lethal dose 50

[中圖分類號]R285.5

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)01-0057-03

*通信作者E-mail:zjj216@163.com網絡出版時間：2016-01-07

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160107.2006.026.html