高氧肺損傷中肺泡形成基因P311的動(dòng)態(tài)變化及意義*

曾寶梅, 王予川, 黃　棟**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng)　550004； 2.貴州省人民醫(yī)院， 貴州 貴陽(yáng)　550002)

?

高氧肺損傷中肺泡形成基因P311的動(dòng)態(tài)變化及意義*

曾寶梅1, 王予川2, 黃棟2**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng)550004； 2.貴州省人民醫(yī)院， 貴州 貴陽(yáng)550002)

[摘要]目的： 探討肺泡形成基因P311在高氧肺損傷中的作用。方法： 成年的昆明小鼠64只，隨機(jī)分為空氣組和高氧組，空氣組置于室內(nèi)空氣中飼養(yǎng)，高氧組置于同一室內(nèi)氧艙中持續(xù)吸入氧濃度>90%的醫(yī)用氧氣復(fù)制高氧肺損傷動(dòng)物模型；分別于1 d、3 d、7 d和14 d后取2組小鼠肺組織，蘇木精-伊紅染色觀察肺組織病理變化并鑒定造模是否成功；免疫組織化學(xué)染色和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR)檢測(cè)P311蛋白的分布和基因表達(dá)；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)P311蛋白含量。結(jié)果： 高氧組小鼠隨著吸入高濃度氧氣時(shí)間的延長(zhǎng)，肺組織病理改變逐漸加重，成功復(fù)制高氧肺損傷的動(dòng)物模型；免疫組織化學(xué)染色顯示P311在肺組織主要定位于肺泡壁及肺泡隔膜生長(zhǎng)點(diǎn)處，在空氣組小鼠肺組織中呈弱陽(yáng)性反應(yīng)，而在高氧組小鼠肺組織中呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)；高氧組小鼠P311基因表達(dá)及蛋白含量較空氣組小鼠增高，隨吸氧時(shí)間的延長(zhǎng)，P311基因表達(dá)及蛋白含量逐漸增高,在第7天時(shí)達(dá)高峰(P<0.05)。結(jié)論： 高氧肺損傷后P311基因表達(dá)增加。

[關(guān)鍵詞]肺泡形成基因； 基因表達(dá)； 高氧癥； 肺損傷； 小鼠

氧療是肺源性及非肺源性疾病所致呼吸衰竭時(shí)不可缺少的治療手段，然而長(zhǎng)時(shí)間吸入高濃度氧氣，機(jī)體氧自由基產(chǎn)生增多，可對(duì)肺組織造成損傷,甚至導(dǎo)致慢性肺疾病(chronic lung disease，CLD)[1-2]。高氧肺損傷是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程, 有諸多因素、系統(tǒng)共同參與和介導(dǎo)高氧肺損傷的病理過(guò)程, 高氧導(dǎo)致的肺損傷越來(lái)越受到臨床醫(yī)生的重視[3]。相關(guān)高氧誘導(dǎo)肺損傷發(fā)生機(jī)制及其干預(yù)策略的研究報(bào)道日漸增多，但收益甚少。通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，P311作為肺泡形成過(guò)程中的重要基因可調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的增生及轉(zhuǎn)分化，減輕疤痕組織的增生，但其在高氧肺損傷修復(fù)中的作用知之甚少。本研究通過(guò)構(gòu)建小鼠高氧肺損傷動(dòng)物模型，在組織水平探索P311在高氧肺損傷中的變化。

1材料及方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

普通級(jí)昆明小鼠購(gòu)自貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心，將60日齡的小鼠隨機(jī)分為空氣組和高氧組，兩組又分為1 d、3 d、7 d和14 d組，每組8只小鼠。

1.2方法

1.2.1高氧肺損傷動(dòng)物模型高氧組小鼠置于氧艙中喂養(yǎng)，用測(cè)氧儀監(jiān)測(cè)氧艙內(nèi)的氧濃度使其維持在90%以上，氧艙內(nèi)溫度與室內(nèi)溫度相當(dāng)，濕度60%左右，CO2濃度低于0.5%。每天定時(shí)開(kāi)艙添加飼料和水,并更換小鼠墊料?？諝饨M均置于同一室內(nèi)空氣中飼養(yǎng)。

1.2.2肺組織病理學(xué)檢查各組小鼠分別于空氣和高氧環(huán)境中飼養(yǎng)1 d、3 d、7 d和14 d后取左肺組織固定在4%多聚甲醛中， 蘇木精-伊紅染色后，光鏡下觀察各組小鼠肺組織的病理變化。并參照文獻(xiàn)按照充血、水腫、出血、炎性浸潤(rùn)、肺泡結(jié)構(gòu)破壞和組織增生等指標(biāo)的輕重程度以及病變范圍進(jìn)行評(píng)分及分析。

1.2.3肺組織P311蛋白分布免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)肺組織P311蛋白的分布，P311多克隆抗體購(gòu)自武漢BOSTER公司，工作濃度1∶200； 二抗及DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司，實(shí)驗(yàn)中以PBS液代替一抗做為陰性對(duì)照，免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)肺組織中P311蛋白分布。

1.2.4肺組織P311mRNA表達(dá)采用Real-Time PCR方法。從肺組織中提取總RNA(按照動(dòng)物組織RNA提取試劑盒的步驟操作)，然后檢測(cè)RNA的完整性、純度及濃度。將符合要求的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的步驟)，然后進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.5肺組織P311蛋白表達(dá)ELISA方法檢測(cè)P311蛋白，肺組織勻漿后采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè),操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1各組小鼠的一般狀況

空氣組小鼠反應(yīng)比較靈敏，活動(dòng)良好，毛發(fā)光澤，鼻尖紅潤(rùn)；高氧組小鼠隨著吸氧時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸表現(xiàn)為反應(yīng)遲鈍，精神萎靡，活動(dòng)度下降，食量明顯減少，體重增長(zhǎng)緩慢，毛發(fā)發(fā)澀、無(wú)光澤，鼻尖發(fā)紺，呼吸急促；停止吸氧后，小鼠表現(xiàn)為呼吸稍困難，鼻尖明顯發(fā)紺，頭顫，站立不穩(wěn)，反應(yīng)差。

2.2肺組織病理變化

肉眼觀察：空氣組小鼠肺組織呈均勻淡紅色，包膜光滑；高氧組小鼠的肺組織表面蒼白，有散在甚至彌漫的出血點(diǎn)。光鏡下觀察：空氣組小鼠肺組織肺泡發(fā)育成熟，無(wú)充血、水腫、出血、炎性浸潤(rùn)、肺泡結(jié)構(gòu)破壞和組織增生等。高氧1 d組小鼠與空氣組小鼠比較無(wú)明顯異常；高氧3 d組小鼠與高氧1 d組小鼠比較，在肺血管、氣管周?chē)醒仔约?xì)胞浸潤(rùn)；高氧7 d組小鼠與高氧3 d組小鼠比較除了有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)外，可見(jiàn)肺泡充血、水腫；高氧14 d組小鼠與高氧7 d組小鼠比較可見(jiàn)肺泡腔明顯增大,部分肺泡融合、肺泡數(shù)量減少,肺間質(zhì)細(xì)胞增生。高氧組小鼠隨著吸氧時(shí)間延長(zhǎng),肺組織病變逐漸嚴(yán)重，表現(xiàn)為肺泡腔內(nèi)炎癥細(xì)胞滲出增多、間質(zhì)水腫，典型小直徑的肺泡數(shù)目顯著減少，肺泡結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單化和囊泡化。肺組織病理變化評(píng)分結(jié)果提示，高氧7 d、14 d組小鼠與同時(shí)段空氣組小鼠比較，肺損傷明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高氧組3 d、7 d、14 d組內(nèi)兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1及表1。

2.3肺組織P311蛋白的分布

P311肺組織中主要定位于肺泡壁及肺泡隔膜生長(zhǎng)點(diǎn)處，在空氣組小鼠肺組織中呈弱陽(yáng)性反應(yīng),部分細(xì)胞質(zhì)呈淺染色。與空氣組小鼠比較，高氧組小鼠隨著吸氧時(shí)間的延長(zhǎng)肺組織中P311逐漸呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)中的棕色顆粒；從吸入高濃度氧后第3天，至第14天P311均呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，見(jiàn)圖2。

注：A為空氣組，B為高氧1 d組，C為高氧3 d組，D為高氧7 d組，E為高氧14 d組圖1　空氣組與高氧組小鼠肺組織蘇木精-伊紅染色(×400) Fig.1　Hematoxylin-eosin staining of lung tissue in air group and hyperoxia group

注：A為空氣組，B為高氧1 d組，C為高氧3 d組，D為高氧7 d組，E為高氧14 d組圖2　空氣組與高氧組小鼠肺組織免疫組織化學(xué)染色(×400)Fig.2　Immunohistochemical staining for air group and hyperoxia group

2.4肺組織P311 mRNA的表達(dá)

空氣組各時(shí)段小鼠肺組織中P311 mRNA表達(dá)無(wú)顯著變化。高氧組小鼠隨著吸氧時(shí)間的延長(zhǎng)，P311 mRNA在肺組織里的表達(dá)逐漸增高，至吸氧第7天時(shí)，P311表達(dá)達(dá)高峰，各時(shí)段高氧組小鼠肺組織P311 mRNA表達(dá)均高于同時(shí)段空氣組小鼠(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.5肺組織P311蛋白的含量

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)顯示，空氣組小鼠肺組織P311蛋白含量無(wú)明顯變化；高氧組小鼠肺組織隨著吸氧時(shí)間的延長(zhǎng)，肺組織中P311蛋白含量逐漸增高，至吸氧第7天時(shí)，P311蛋白含量達(dá)高峰。各時(shí)段高氧組小鼠肺組織中P311蛋白含量均高于同時(shí)段空氣組小鼠(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表1　兩組小鼠肺組織病理變化評(píng)分(分)

(1)與空氣組比較，P<0.05；(2)高氧組各時(shí)段內(nèi)比較，P<0.05

表2　兩組小鼠肺組織P311 mRNA表達(dá)及

(1)與空氣組比較，P<0.05；(2)高氧組各時(shí)段內(nèi)比較，P<0.05

3討論

盡管氧氣對(duì)于挽救生命是必須的，但長(zhǎng)時(shí)間吸入高濃度的氧氣對(duì)于細(xì)胞、器官而言都具有危害性[4]。肺臟直接與外界相通，因此長(zhǎng)時(shí)間暴露在高濃度氧氣環(huán)境下最易受損[5-6]。高氧肺損傷早期病理改變?yōu)閺浡苑闻菅装Y，晚期肺泡間質(zhì)增生，肺纖維化。肺纖維化影響患者今后肺功能，如何減輕高氧肺損傷患者肺纖維化，改善肺功能，促進(jìn)肺損傷的無(wú)纖維化修復(fù)一直是醫(yī)學(xué)研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。研究證實(shí)通過(guò)抑制性差減雜交技術(shù)(suppression substractive hybridization，SSH)克隆，在肺泡發(fā)生相關(guān)階段特異表達(dá)的P311基因[7]，全長(zhǎng)2 025 bp，編碼分子質(zhì)量8 kDa、由68個(gè)氨基酸組成的多肽，在人和小鼠等物種間高度保守[8]。P311廣泛表達(dá)于多種組織細(xì)胞中，是一種胞內(nèi)蛋白，主要存在于胞漿，在核內(nèi)亦有少量定位。P311主要參與受損神經(jīng)系統(tǒng)的再生[9-10]、促進(jìn)成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化[8,11]，并且與腫瘤細(xì)胞的遷移、浸潤(rùn)等密切相關(guān)[12-13]。P311在肺組織中主要定位于肺泡壁及肺泡隔膜生長(zhǎng)點(diǎn)處，相對(duì)于成熟肺組織，P311基因及編碼蛋白在原始肺泡期到肺泡形成初期的表達(dá)明顯升高，而后在肺泡期達(dá)到最高峰，并在整個(gè)肺泡形成階段保持高水平表達(dá)，這些結(jié)果均提示P311可能與肺泡形成有關(guān)。研究還顯示，高表達(dá)P311的肺成纖維細(xì)胞可轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞在肺泡發(fā)育及再生過(guò)程中及肺泡隔膜的形成中起著重要的作用，如次級(jí)隔膜發(fā)生及肺泡重建所必需的彈性蛋白均由肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，提示P311在防止肺損傷或?qū)κ軗p肺組織的修復(fù)中發(fā)揮重要的作用。本研究將小鼠置于高濃度氧氣環(huán)境中，小鼠第3天開(kāi)始肺組織形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，至第14天時(shí)可見(jiàn)不同程度的肺損傷，隨著吸入高濃度氧氣時(shí)間的延長(zhǎng),早期為炎性反應(yīng), 后期肺泡結(jié)構(gòu)逐漸簡(jiǎn)單化、纖維化[14-15]。本實(shí)驗(yàn)成功建立高氧肺損傷小鼠模型，并通過(guò)免疫組化、real-time PCR及ELISA方法，檢測(cè)到P311主要表達(dá)于肺泡壁及肺泡隔膜生長(zhǎng)點(diǎn)處，與空氣組比較，隨著吸入高濃度氧氣時(shí)間的延長(zhǎng)肺損傷加重，P311 mRNA和蛋白表達(dá)均高于同時(shí)段空氣對(duì)照組，并于高氧肺損傷發(fā)生的第7～14天時(shí)達(dá)高峰。實(shí)驗(yàn)提示P311基因可能是肺損傷修復(fù)的新的調(diào)控因子，可能通過(guò)調(diào)節(jié)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞和肺成纖維間質(zhì)細(xì)胞再生和轉(zhuǎn)分化，促進(jìn)肺泡分隔膜的形成，抑制肺間質(zhì)纖維化形成來(lái)影響肺的修復(fù)。

4參考文獻(xiàn)

[1] Kallet RH，Matthay MA. Hyperoxic acute lung injury[J].Respir Care， 2013(1):123-141.

[2] Berkelhamer SK，Kim GA，Radder JE，et al.Developmental differences in hyperoxia-induced oxidative stress and cellular responses in the murine lung[J].Free Radic Biol Med， 2013(61):51-60.

[3] 胡良岡，錢(qián)燕，龔永生.SPF級(jí)新生大鼠高氧肺損傷模型的建立[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)， 2008(6):441-443.

[4] Makena PS，Gorantla VK，Ghosh MC，et al．Lung injury caused by high tidal volume mechanical ventilation and hyperoxia is dependent on oxidant-mediated c-Jun NH2-terminal kinase activation[J].J Appl Physiol, 2011(5):1467-1476．

[5] Park HS, kim SR, Lee YC. Impact of oxidative stress on lung diseases[J]. Respirology, 2009(1):27-38．

[6] Tasaka S，Amaya F，Hashimoto S，et al．Roles of oxidants and redox signaling in the pathogencsis of acute respiratory distress syndrome[J].Antioxid Redox Signal, 2008(4):739-753．

[7] Zhao LQ，Leung JK， Yamamoto H，et al.Identification of P311 as a potential gene regulating alveolar generation[J].Am J Resp Cell Mol， 2006(10):48-54.

[8] Pan D，Zhe X，Jakkaraju S，et al．P311 induces a TGF-beta 1-independent，nonfibrogenic myofibroblast phenotype[J].J Clin Invest, 2002(9):1349-1358.

[9] Fujitani M，Yamagishi S，Che YH，et al．P3ll accelerates nerve regeneration of the axotomized facial nerve[J].J Neurocherrt, 2004(3): 737-744.

[10]Erhardt JA，Pittman RN．Ectopic p21 WAF 1 expression induces differentiation-specific cell cycle changes in PCI 2 cells characteristic of nerve growth factor treatment[J].J Biol Chem, 1998(7):23517-23523.

[11]Paliwal S，Shi J，Dhru U，et al．P311 bings to the latency associate protein and downregulates the expression of TGF-betal and TGF-beta2[J].Biochem Biophys Res Commun, 2004(4):1104-1109.

[12]Mariani LW, McDonough S，Hoelzinger DB，et al．Identification and validation of P3ll as glioblastoma invasion gene using laser capture micro-dissection[J].Cancer Res, 2001(5):4190-4196.

[13]Fang MZ, Liu C，Song Y,et al．Overexpression of gastrin-releasing peptide in human esophageal squamous cell carcinomas[J].Carcinogenesis， 2004(6):865-871.

[14]張向峰,朱光發(fā),劉雙,等.基質(zhì)金屬蛋白酶-2/9 及其組織抑制劑比例失衡在高氧所致急性肺損傷中的作用[J].中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué), 2008(10):597-600.

[15]Perkowski S,Scherpereel A,Murciano JC,et al. Dissociation between alveolar transmigration of neutrophils and lung injury in hyperoxia [J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2006(5):1050-1058.

(2015-07-20收稿，2015-10-07修回)

中文編輯： 劉平； 英文編輯： 劉華

The Dynamic Change and Significance of Alveoli-Forming GeneP311 Expression in Hyperoxia-induced Lung Injury

ZENG Baomei1, WANG Yuchuan2, HUANG Dong2

(1.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.GuizhouProvincialPeople'sHospital,Guiyang550002,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To explore expression and significance of P311 gene of alveoli forming. Method: Sixty days old adult KM mice were divided into air group and hyperoxia group. Mice of air group were fed in the ordinary room air while mice of hyperoxia group were fed in oxygen chamber of the same room and continuously inhaled high concentration medical oxygen(oxygen concentration>90%). After 1, 3, 7and 14 days, the lung tissues were taken to observe histopathological changes by hematoxylin-eosin staining and check whether the model building was successful or not. The expression of P311 mRNA level and the P311 protein location were detected by real-time PCR and immunohistochemistry respectively, and protein content of P311 was detected by ELISA. Result: In hyperoxia group, with extension of time of inhalation of high-concentration oxygen, the lung tissue pathological changes aggravated gradually, which meant hyperoxia-induced lung injury model building was successful. Immunohistochemical staining of lung tissue showed that P311 was mainly located in the alveolar walls and alveolar septum growing point in the lung tissue, and took on weak positive reaction in air group but strong positive reaction in the high oxygen group. Compared with air group, P311 gene expression and protein content were significantly higher in hyperoxia group. Besides, with extension of time of inhalation of high-concentration oxygen, P311 gene expression and protein content increased gradually and reached the peak on 7thday (P<0.05). Conclusion: P311 gene expression is upregulated in hyperoxia-induced lung injury.

[Key words]alveoli-forming gene; gene expxession; hyperoxia; lung injury; mice

[中圖分類(lèi)號(hào)]R34-33

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)01-0027-05

*[基金項(xiàng)目]貴州省科技廳科研項(xiàng)目[黔科合J字(2011)2250號(hào)]

**通信作者 E-mail:hd522523@163.com網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-07-01

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150701.2038.031.html