內皮型一氧化氮合成酶基因rs3918181位點多態性與貴州漢族原發性高血壓的關系*

張旺德， 趙孝梅， 刁曉艷， 何　燕*， 官志忠

(1.貴州醫科大學 分子生物學重點實驗室， 貴州 貴陽　550004； 2.貴州醫科大學附院 心血管內科， 貴州 貴陽　550004)

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內皮型一氧化氮合成酶基因rs3918181位點多態性與貴州漢族原發性高血壓的關系*

張旺德1**， 趙孝梅1， 刁曉艷2， 何燕1***， 官志忠1

(1.貴州醫科大學 分子生物學重點實驗室， 貴州 貴陽550004； 2.貴州醫科大學附院 心血管內科， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 探討貴州省漢族人群內皮型一氧化氮合成酶(eNOS)基因第14內含子rs3918181位點多態性與原發性高血壓(EH)的關系。方法： 選取貴州漢族人群的原發性高血壓患者169例和健康對照者164例，應用TaqMan探針法對eNOS基因rs3918181位點進行基因分型，分析不同基因型與EH發病關系。結果： EH組患者的AA、AG和GG基因型頻率分別為0.095、0.426和0.479，對照組分別為0.104、0.408和0.488，兩組間差異無統計學意義(P>0.05)；EH組A與G等位基因頻率分別為0.308和0.692，對照組分別為0.308和0.692，兩組間差異無統計學意義(P>0.05)。結論： eNOS基因rs3918181位點多態性與貴州省漢族原發性高血壓可能無關。

[關鍵詞]高血壓； 一氧化氮合酶； 基因多態性； 等位基因； 基因型； 漢族； 貴州

原發性高血壓(essential hypertension, EH)是多基因遺傳病，受遺傳和環境因素的共同作用，但遺傳因素起著重要作用，因此從基因水平探討EH的發病機制是重要的研究方向[1]。近年來國內外研究發現，內皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因多態性與高血壓有密切關系，被認為是高血壓的重要候選基因[2]。本研究旨在探討eNOS基因rs3918181位點多態性與貴州省漢族人群EH的關系。

1對象與方法

1.1研究對象

選擇2014年3月～2015年3月在心內科門診及住院部就診的高血壓患者169例為EH組，按2010年中國高血壓防治指南的標準診斷；排除繼發性高血壓、心肌病、瓣膜疾病、先天性心臟病及肝、腎衰竭，孕婦、哺乳期婦女以及精神疾病史或濫用藥物者，EH組男性75例，女性94例，平均(58.08±11.29)歲。另選健康體檢者共164例，其中男75例，女89例，平均年齡(55.84±10.51)歲，無高血壓家族史，無各類心血管、腦血管、腎、內分泌等方面疾病。兩組研究對象在性別、年齡構成上差異無統計學意義。兩組均為貴州籍漢族人，相互間均無血緣關系。

1.2方法

1.2.1血壓測定采用校正的水銀柱式血壓計(刻度以2 mmHg為單位)于上午10∶00～12∶00測定血壓；測血壓前30 min 內禁止吸煙和飲咖啡，避免勞累、緊張和興奮，靜坐5 min，裸露右側上臂，肱動脈置于和心臟同一水平線位置，每次重復測量3 次，測量相隔5 min/次，取3 次測量的平均值，由專人使用相同血壓計測量。

1.2.2基因組DNA的提取實驗前夜禁食12 h以上，次晨抽取空腹肘靜脈血液標本5 mL，用EDTA抗凝管；按經典常規法(酚-氯仿法)抽提白細胞DNA，溶于TE；紫外吸收法定量后標化模板為30 g/L，-40 ℃備用。

1.2.3基因分型應用TaqMan 實時熒光定量PCR技術對eNOS基因rs3918181位點進行基因分型。PCR反應體系為10 μL：模板DNA 1.5 μL，通用TaqMan PCR Master Mix 5 μL，20×Assay Working Stock 0.25 μL，加ddH2O補足10 μL。TaqMan PCR Master Mix、20×Assay Working Stock均購自美國ABI公司，內含的兩個探針分別用VIC、FAM染料標記。反應條件為：60 ℃ 30 s，95 ℃10 min，95 ℃ 15 s，60℃ 1 min 20 s，共55個循環，60 ℃ 30 s，儀器采用美國AB公司生產的Step One Plus 實時熒光定量PCR系統，讀取VIC/FAM熒光判斷基因分析結果。VIC熒光探針識別A等位基因，FAM熒光探針識別G等位基因。每塊96孔板設3孔陰性對照，并隨機抽取5%樣本復測，一致性為100%。

1.3統計學處理

統計分析采用SPSS 19.0軟件。研究對象的Hardy-weinberg平衡符合程度、組間基因型、等位基因頻率比較采用χ2檢驗。兩組計量資料組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1基因型分布的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測

實驗結果顯示，EH組和對照組人群eNOS基因rs3918181位點均存在A和G等位基因，有AA純、AG雜合、GG純3種基因型，見圖1。兩組的基因型頻率經χ2檢驗，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(P>0.05)，見表1。

注：紅點、綠點、藍點分別為rs3918181位點AA野生純合型、AG雜合型、GG純合突變型，黑色方塊代表空白對照(NTC)圖1　人基因組rs3918181 (eNOS) 位點TaqMan探針實時熒光定量PCR分型Fig.1　The genotyping results of rs3918181 (eNOS) SNP loci by using TaqMan probe real-time quantitative PCR

2.2基因型和等位基因頻率分布

經χ2檢驗兩組基因型頻率分布差異無統計學意義(χ2=0.141，P>0.05)，兩組等位基因頻率分布差異無統計學意義(χ2=0.000，P>0.05)，見表1。

表1　兩組被檢者eNOS基因rs3918181位點的基因型和等位基因頻率分布

3討論

eNOS基因在人類染色體上位于7q35-q36，全長約21 kb，包含26個外顯子和25個內含子，其編碼的mRNA可翻譯生成1 203個氨基酸[3]。eNOS的作用是催化血管內皮左旋精氨酸和氧分子經多步氧化還原反應生成一氧化氮(NO)，內皮來源的NO是調節血壓和維持正常血流的重要分子[4]；研究表明人體內源性NO的持續生成主要由eNOS調節，因此eNOS基因序列的多態性通過影響eNOS的功能而影響人體內NO的濃度[5]。Bonnardeaux[6]等研究顯示，eNOS的表達異?；騟NOS的活性降低，NO的合成就會減少，引起機體的外周血管阻力增加，血壓就會升高。故eNOS基因已成為高血壓病的候選基因之一。

目前國內外關于eNOS基因多態性與EH關系研究多集中于第7外顯子894位點[7-9]、啟動子區786位點[10-12]以及第4內含子[13-15]，對第14內含子的研究相對較少，但所得結論都仍有爭議。許多位于基因功能未知的區域或非編碼區的遺傳標記與疾病相關，內含子是基因組中重要的調控元件,可以直接對基因的表達起調控作用，也可通過自身的剪接影響基因的表達。高鵬等[16]對eNOS基因14內含子rs3918181位點多態性與腦卒中合并高血壓關系的研究結果表明，eNOS基因rs3918181位點多態性可能與高血壓的發生有關。閆雪等[17]對天津漢族290例EH患者和161名健康對照者的eNOS基因rs3918181位點多態性與EH的關系的研究結果顯示，EH組患者AA、AG和GG基因型分布頻率分別為0.293、0.393和0.314，A與G等位基因頻率分別為0.490和0.510，與對照組相比基因型分布頻率及等位基因頻率差異有統計學意義，eNOS基因rs3918181位點多態性與EH相關。而關于eNOS基因rs3918181位點多態性與貴州地區漢族人群EH的關系研究至今尚未見報道。因此，本研究選取第14內含子rs3918181位點對貴州漢族人群的EH患者169例和健康對照者164例進行研究分析，結果顯示EH組患者的AA、AG和GG基因型分布頻率分別為0.095、0.426和0.479，A與G等位基因頻率分別為0.308和0.692，與對照組相比基因型分布頻率及等位基因頻率差異無統計學意義(P>0.05)，表明eNOS基因rs3918181位點多態性與貴州漢族EH可能不相關。這與高鵬等[16]和閆雪等[17]的研究結果相反。而與楊波等[18-19]研究結果一致。以上研究結果間存在差異的可能原因：(1)研究方法及樣本來源不同；(2)研究對象的遺傳背景及基因多態性位點的作用強度不同；(3)生活習慣及居住環境不同。

總之，本研究結果提示eNOS基因rs3918181位點多態性與貴州漢族人群中EH可能無關，但本研究的樣本量較小，容易產生統計偏差，仍需要進一步擴大樣本量加以證實。

4參考文獻

[1] 李東寶，華琦，皮林.內皮型一氧化氮基因G894T多態性與原發性高血壓的相關關系[J]. 高血壓雜志, 2004(4):326-330.

[2] 盧賢貴, 唐斌, 何芳, 等. 新疆哈薩克族內皮型一氧化氮合成酶基因rs7830和rs3918188多態性與原發性高血壓的相關性[J]. 中國病理生理雜志, 2012(10):1779-1783.

[3] Miyahara K, Kawamoto T, Sase K, et al. Cloning and structural characterization of the human endothelial nitric oxide-synthase gene [J]. Eur J Biochem, 1994(3):719-726.

[4] 王從, 孫剛, 閆旭龍, 等.蒙族高血壓患者內皮型一氧化氮合酶基因多態性研究[J]. 中國分子心臟病學雜志, 2006(2): 81-84.

[5] Ikenouchi-Sugita A, Yoshimura R, Kishi T, et al. Three polymorphisms of the eNOS gene and plasma levels of metabolites of nitric oxide in depressed Japanese patients: a preliminary report[J]. Hum Psychopharmacology, 2011(7): 531-534.

[6 ] Bonnardeaux A, Ndaud S, Charru A. Lack of evidence for linkage of the endothelial cell nitric oxide synthase gene to essential hypertension[J]. Circulation, 1995(1):96-102.

[7] Sediri Y, Kallel A, Ayadi I, et al. Lack of association between endothelial nitric oxide synthase gene G894T polymorphism hypertension in the Tunisian population[J]. Prev Med, 2010(1): 88-89.

[8] 張強, 鄧峰美, 何芳, 等. 新疆漢族和哈薩克族人群內皮型一氧化氮合成酶基因T786C和G894T多態性與原發性高血壓的相關分析[J]. 中國動脈硬化雜志, 2012(3): 265-272.

[9] 周明, 黨書毅, 王俊峰, 等. 中國漢族人群eNOS基因G894T多態性與原發性高血壓關系的Meta分析[J]. 中國循證心血管醫學雜志, 2012(4):408-411.

[10]Fernandez ML, Ruiz R, Gonzalez MA. et al. Association of NOS3 gene with metabolic syndrome in hypertensive patients[J]. Thromb Haemost, 2004(2): 413-418.

[11]李東寶,華琦,皮林. 內皮型一氧化氮合酶T786C多態性與原發性高血壓的相關關系[J].首都醫科大學學報, 2006(2): 226-229.

[12]鄒放君, 唐斌, 何芳, 等. 內皮型一氧化氮合酶基因T786C多態性與新疆漢族原發性高血壓的相關性研究[J]. 中國慢性病預防與控制, 2011(2): 114-117.

[13]Nejatizadeh A, Kumar R, Stobdan T, et al.Endothelial nitric oxide synthase gene haplotypes and circulating nitric oxide levels significantly associate with risk of essential hypertension[J]. Free Radi Biol Med, 2008(11): 1912-1918.

[14]王剛, 唐斌, 何芳, 等. eNOS基因27bpVNTR多態性與新疆哈薩克族原發性高血壓的相關性研究[J]. 石河子大學學報:自然科學版, 2010(3): 335-339.

[15]方玲, 王檸, 林珉婷, 等.內皮型一氧化氮合酶基因第4內含子基因多態性與福建漢族腦血管病的相關性[J]. 中國神經精神疾病雜志, 2011(11): 687- 690.

[16]Gao P, Du DH, Zhao JX, et al. A study of the NOS3 gene polymorphism for ischemic stroke with hypertension.Chinese[J]. Joumal of Gerontology, 2008(22): 2230-2231.

[17]閆雪, 王偉, 毛用敏. 內皮型一氧化氮合酶基因 rs3918181位點多態性與原發性高血壓的關系研究[J]. 中國心血管雜志, 2013(4): 280-282.

[18]楊波, 徐金瑞, 納小菲, 等. 寧夏漢族人群eNOS基因3個SNP位點與原發性高血壓相關性研究[J]. 實用醫學, 2012(21): 3509-3512.

[19]Yang B, Xu JR, Liu XM, et al. Polymorphisms of rs1799983 (G>T) and rs1800780(A>G)of the eNOS gene associated with susceptibility to essential hypertension in the Chinese Hui ethic population[J]. Genet Mol Res, 2013(3):3821-3829.

(2015-10-08收稿，2015-11-30修回)

中文編輯： 周凌； 英文編輯： 劉華

Relationship between Rs3918181 Polymorphism of Endothelial Nitric Oxide Synthase Gene and Essential Hypertension of Han Population in Guizhou

ZHANG Wangde1， ZHAO Xiaomei1， DIAO Xiaoyan2， HE Yan1， GUAN Zhizhong1

(1.KeyLaboratoryofMolecularBiology，GuizhouMedicalUniversity，Guiyang550004，Guizhou，China；2.InternalMedicine-

CardiovascularDepartment，AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity，Guiyang550004，Guizhou，China)

[Abstract]Objective: To investigate the relationship between intron 14 th rs3918181 locus polymorphism of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) gene and essential hypertension (EH) in Han population of Guizhou Province. Methods: TaqMan probe method was adopted to analyse the rs3918181 polymorphism genotype of eNOS gene in 169 cases with EH and 164 cases of normal control group. Then the relationship between different genotypes and EH were explored. Results: The frequencies of AA, AG and GG genotypes were 0.095, 0.426 and 0.479 in EH group respectively, while the frequencies of AA, AG and GG genotypes were 0.104, 0.408 and 0.488 in control group respectively. There was no significant difference in frequencies of genotype distribution between two groups (P>0.05). The frequencies of A and G alleles were 0.308, 0.692 in EH group, and 0.308, 0.692 in control group. There was no significant difference in frequencies of allele distribution between two groups (P>0.05). Conclusions: The genetic polymorphism of rs3918181 locus in eNOS gene may not be associated with EH susceptibility in Han population of Guizhou Province.

[Key words]hypertension; nitric oxide synthase; genetic polymorphism; alleles; genotype; han population; Guizhou

[中圖分類號]R342; R544.11

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)01-0008-04

*[基金項目]國家科技支撐計劃項目(2013BAI05B03)； 貴州省“2011協同創新中心”[黔教合協同創新中心(2014)06號]

**貴州醫科大學研究生學院2014級碩士研究生

***通信作者 E-mail:annieheyan@gmc.edu.cn網絡出版時間：2016-01-07

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160107.1825.008.html