米諾環素對神經病理性疼痛大鼠脊髓神經膠質細胞GTs表達的影響①

曲詩言，喬建民

(佳木斯大學附屬第一醫院骨外科，黑龍江 佳木斯154003)

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米諾環素對神經病理性疼痛大鼠脊髓神經膠質細胞GTs表達的影響①

曲詩言，喬建民

(佳木斯大學附屬第一醫院骨外科，黑龍江 佳木斯154003)

摘要：目的：觀察米諾環素對神經病理性大鼠脊髓神經膠質細胞的水平谷氨酸轉運蛋白(GTs)表達的影響, 探討神經病理性疼痛中的作用機制和治療方法。方法：將40只成年雄性SD大鼠，采用坐骨神經結扎術建立神經病理性疼痛模型。根據手術類型及注射藥物，隨機分成4組:A組，假手術組 (n=10)；B組，手術組(n=10)；C組，生理鹽水+手術組(n=10)；D組，米諾環素+手術組(n=10)。在術后，第 1、3、7、11天觀察熱縮足反射潛伏期(TWL)、測定大鼠機械縮足閾值(MWT)的變化，應用Western Blot方法檢測檢測大鼠脊髓神經膠質細胞GTs表達。結果：手術組(BCD組)大鼠較假手術組(A組)，熱縮足反射潛伏期明顯縮短，且大鼠50%機械縮足閾值明顯降低。鞘內注射米諾環素組(D組)大鼠與對照組(BC組)比較，其熱縮足反射潛伏期明顯延長，且大鼠50%機械縮足閾值明顯升高，并且脊髓神經膠質細胞GTs的表達明顯高于BC組。結論：米諾環素能夠通過維持大鼠脊髓神經膠質細胞谷氨酸轉運蛋白(GTs)表達的影響，從而緩解神經病理性疼痛。

關鍵詞：米諾環素; 谷氨酸轉運蛋白;神經病理性疼痛;大鼠

隨著社會發展和人們生活水平提高 ,神經病理性疼痛的診治需求逐漸增加。但是現在很多的治療藥物和方法欠佳, 探究其發病機制和診療方案具有很重要的意義。神經病理性疼痛( neuropathicpain，NPP) 是由于外周或中樞神經系統受到損傷或產生病變而導致的疼痛[1]。 NPP的主要特征包括痛過敏( hyperalgesia) 痛過度( hyperpathia) 及異常痛( allodynia)，由于其病因多樣，發病機制至今尚未徹底闡明，已經成為臨床醫療最具挑戰的難題之一。谷氨酸轉運蛋白(glutamate transporters，GTS)在決定神經元的激活和影響神經元興奮性方面發揮著重要作用[2]。位于神經膠質細胞和神經元質膜的GTs迅速從細胞外間隙攝取突觸釋放的谷氨酸，維持細胞外谷氨酸濃度的平衡。米諾環素的鎮痛作用與其抑制脊髓背角神經膠質細胞的活化和促炎性細胞因子的表達相關。本研究旨在探究米諾環素對于脊髓神經膠質細胞GTs的表達的影響，進一步揭示病理性疼痛產生的機制。

1材料與方法

1.1動物分組

成年雄性SD大鼠40只, 體重200～250g, 由佳木斯大學醫學院動物實驗中心提供。根據手術類型及注射藥物，隨機分成4組:A組，假手術組 (n=10)；B組，手術組(n=10)；C組，生理鹽水+手術組(n=10)；D組，米諾環素+手術組(n=10)。

1.2模型制備

將SD大鼠稱重后，常規行鞘內注射麻醉，藥物劑量10%水合氯醛(300mg/kg 體重)，將大鼠放置為側臥位。消毒鋪巾，嚴格無菌操作。切開左下肢股部皮膚，將肌肉組織鈍性分離，輕柔暴露坐骨神經，在其主干部位處用羊腸線松扎四道，但不影響神經外膜的血運。逐層縫合切口，對側下肢肌注慶大霉素(0.2mL，10mg/mL)預防感染[3]。A 組假手術組，分離暴露坐骨神經干，不結扎。所有手術操作均由同一人完成。D組大鼠于建模前1d開始鞘內注射米諾環素(Sigma)50μg(溶于20μL生理鹽水中)，之后每天1次，連續注射7d，C組大鼠在相同時點鞘內注射生理鹽水。A組和B組大鼠鞘內不予任何藥物。

1.3測試動物行為學

1.3.1熱痛潛伏期(Thermal withdrawal latency，TWL)測定[4]。將大鼠在放置操作臺5min，后進行光照射，每個大鼠下肢照射3次，記錄照射至出現縮足反應時間，取其平均值。

1.3.2機械縮足閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)測定。將大鼠用不同壓力的von Frey纖維絲(Stoeling公司，美國)垂直刺激其足底2、3跖趾間皮膚敏感處4~5s。每次間隔5秒，連續10次，誘發4~6次縮足反應作為50%反應率。

1.4大鼠脊髓背角GTs蛋白含量檢測

采用Western blot檢測大鼠脊髓背角GTs蛋白含量。將動物斷頭處死,取出腰4和腰5脊髓節段，切取脊髓后角用于Western blot。將組織蛋白提取后，按常規方法進行SDS-PAGE電泳，恒流350mA，90min轉膜。脫脂奶粉封閉后，加入抗大鼠的GTs(GLAST 和GLT-1)單克隆抗體，4℃過夜。辣根過氧化物酶(HPR)標記二抗(山羊抗鼠IgG)，37℃孵育1h。采用ECL化學發光法檢測蛋白表達量[5]。

1.5統計學方法

采用SPSS15.0進行統計分析, 計量資料組內比較用配對t檢驗, 組間比較采用單因素方差分析, 以P<0.05作為檢驗水準。

2結果

2.1神經病理性疼痛模型建立成功

坐骨神經結扎術后，手術組(BCD組)大鼠較假手術組(A組)，熱縮足反射潛伏期明顯縮短，且大鼠50%縮足閾值明顯降低。見圖1。

2.2米諾環素對神經病理性疼痛的作用

D組大鼠鞘內注射米諾環素，術后與BC組比較，其熱縮足反射潛伏期明顯延長，且大鼠50%縮足閾值明顯升高。鞘內注射米諾環素可以緩解神經病理性疼痛。見圖1。

2.3米諾環素對病理性疼痛大鼠脊髓神經膠質細胞GTs表達的影響

經過Western Blot檢測，D組大鼠脊髓神經膠質細胞GTs的表達明顯高于BC組，略低于A組。見圖2。

圖1大鼠熱敏、機械縮足反射閾值的變化

圖2　大鼠脊髓神經膠質細胞GTs的表達水平

*P<0.05vsA組#P<0.05vsC組

3討論

隨著社會發展和人們生活水平提高,診治神經病理性疼痛的患者及要求增多。然而，目前大部分的治療藥物和方法效果欠佳,或副作用明顯。因此探究神經病理性疼痛的發病機制和診療方案具有很重要的意義。神經病理性疼痛( neuropathicpain，NPP)包括痛過敏( hyperalgesia) 痛過度( hyperpathia) 及異常痛( allodynia)[1]，其發生主要的發生原因是外周或中樞神經系統受到損傷或產生病變而導致的疼痛。神經病理性疼痛病因復雜多樣，發病機制未闡述清楚，亟待臨床工作者關注與解決。谷氨酸轉運蛋白(glutamate transporters，GTS)在決定神經元的激活和影響神經元興奮性方面發揮著重要作用[2]。位于神經膠質細胞和神經元質膜的GTs迅速從細胞外間隙攝取突觸釋放的谷氨酸，維持細胞外谷氨酸濃度的平衡。米諾環素的鎮痛作用與其抑制脊髓背角神經膠質細胞的活化和促進細胞的炎性因子的表達相關。神經病理性疼痛的模型構建主要通過坐骨神經結扎術。有研究表明，坐骨神經部分結扎(pSNL)的小鼠的脊髓神經膠質細胞GTs攝取谷氨酸不足，導致突觸外的谷氨酸溢出和突觸外NMDA受體激活，這是引起pSNL所致神經病理性疼痛大鼠NMDA受體激活增強的關鍵[3]。已經克隆出 5 種高親和力GTs，包括 EAAT1(GLAST)、EAAT2(glial glutamate transpor-1，GLT-1)、EAAT3(EAAC1)、EAAT4、EAAT5[6,7]。其中 GLAST和 GLT-1 主要表達于神經膠質細胞。米諾環素是半合成的四環素抗生素，能夠穿透血腦屏障進入中樞系統[8]，此外，有研究表明，米諾環素能夠有效的抑制小膠質細胞細胞活性[9]。有研究表明，米諾環素能夠緩解神經病理性疼痛[10]。國內外眾多實驗研究證實, 米諾環素通過直接阻斷小膠質細胞的增殖和激活作用從而減少其神經毒性作用[11]。本研究旨在探討，米諾環素是否能夠對谷氨酸轉運蛋白(GTs)的表達產生作用，從而緩解神經病理性疼痛。本研究中,采用坐骨神經結扎術，成功建立神經病理性疼痛模型。手術組(BCD組)術后第一天，即出現50%縮足閾值較術前基礎值有明顯下降,同時熱縮足反射潛伏期也明顯縮短。可以證明，坐骨神經結扎術成功構建大鼠的神經病理性疼痛模型。且疼痛表現能夠穩定持續至實驗結束。此外，鞘內注射米諾環素組的大鼠(D組)，術后與鞘內注射生理鹽水和空白的對照組(BC組)比較，其熱縮足反射潛伏期明顯延長，且大鼠50%縮足閾值明顯升高。由此可見，鞘內注射米諾環素可以緩解神經病理性疼痛。這與國內外眾多學者的實驗結論是一致的。本研究通過Western Blot方法檢測各組大鼠脊髓神經膠質細胞中GTs的含量。結果發現，各手術組(BCD組)GLAST，GLT-1的表達量均明顯低于假手術組(A組)。而鞘內注射米諾環素組(D組)的大鼠的GTs的表達，又明顯高于生理鹽水(BC組)對照組。據此，我們推測，米諾環素通過通過維持脊髓神經膠質細胞GTs的表達與防止GTs攝取突觸間隙谷氨酸不足而產生緩解神經病理性疼痛的作用。米諾環素能夠通過維持大鼠脊髓神經膠質細胞GTs表達的影響，從而緩解神經病理性疼痛。

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The effect of minocycline on GTs expression in spinal cord of rats with neuropathic pain

QUShi-yan,QIAOJian-min

(The First Affiliated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154003,China)

Abstract:Objective: To analyze the effects of minocycline on glutamate transporters (GTs) expression in spinal cord of rats during neuropathic pain; and to study the mechanism of neuropathic pain.Methods: Forty adult male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into 4 groups (n =10 each): Group A , Sham operation group;Group B, operation group; Group C physiological saline and operation group; group D, minocycline and operation group. Thermal withdrawal latency (TWL) and mechanical withdrawal threshold(MWT)were measured on 1st，3rd，7th and 11th days. GTs expression in the dorsal horn was detected by Western blotting.Results: Mechanical tenderness was occurred in Group B, C and D on he 7th day after operation, and then persisted to the end of the experiment. TWL and MWT were decreased significantly in Group B,C,D than those in group A. Compared with Group B and C，Group A was increasing significantly in TWL and MWT.The expression of GTs was higher in Group D than that in group B and C.Conclusion: Minocycline can prevent the development of neuropathic pain, and up-regulate GTs during the development of neuropathic pain.

Key words:minocycline; glutamate transporters; neuropathic pain rat

(收稿日期：2015-03-19)

中圖分類號：R441.1

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0104(2016)01-0089-02

作者簡介：曲詩言(1986~)男，黑龍江佳木斯人，在讀碩士研究生。通訊作者：喬建民(1960~)男,黑龍江佳木斯人，學士，主任醫師,教授,碩士研究生導師。E-mail：qushiyan1986@163.com。