魚腥草內生放線菌F03培養條件的優化及抑菌活性物質的初步研究

于　哲，張　爽

(陜西國際商貿學院醫藥學院，陜西 咸陽 712000)

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魚腥草內生放線菌F03培養條件的優化及抑菌活性物質的初步研究

于哲，張爽

(陜西國際商貿學院醫藥學院，陜西 咸陽 712000)

摘要：F03是分離于秦嶺野生魚腥草根部的一株抗菌活性較強的內生放線菌。以金黃色葡萄球菌為指示菌，采用單因素實驗和正交實驗對魚腥草內生放線菌F03培養基的碳源、氮源和發酵條件進行優化，并對發酵液抑菌活性物質進行初步研究。優化后的最佳培養基為：葡萄糖30 g，蔗糖10 g，黃豆粉10 g，蛋白胨10 g，K2HPO4 0.3 g，NaCl 1 g，CaCO3 2 g，蒸餾水1 000 mL；最優發酵條件為：發酵液初始pH值8，發酵時間7 d，發酵溫度28 ℃，搖床轉速140 r·min-1，接種量7%；抑菌活性物質的熱穩定性和酸堿穩定性好；Doskochilova溶劑系統紙層析測定結果表明，該發酵液中對金黃色葡萄球菌具有抑菌活性的物質為水溶性抗生素。

關鍵詞：內生放線菌；最佳培養基；發酵條件；優化；魚腥草；抑菌活性物質

植物內生菌因能產生與宿主植物相似或活性更強、結構更新穎的代謝產物而成為近年來的研究熱點。目前使用的抗生素大部分來自放線菌的代謝產物，其中鏈霉菌屬產生的抗生素種類最多[1-3]。植物內生放線菌作為一類特殊環境下的新型微生物資源，是植物微生態系統中最重要的組成部分，在防治疾病和減輕病害等方面具有獨特優勢。因此，從植物內生放線菌中尋找和開發具有抑菌活性的菌株和新型的生物制劑，對推動我國醫藥發展和農業生產具有重要的理論和現實意義。

魚腥草為藥食兩用植物，具有清熱解毒、消癰排膿、利濕通淋等功效，且對多種細菌、真菌均有較明顯的抗菌作用[4]。近年來，魚腥草內生菌受到研究者的廣泛關注。胡汝曉等[5]研究了魚腥草不同部位內生菌的分布情況，發現魚腥草不同部位存在著大量的內生菌，開發潛力巨大。楊春平等[6]對魚腥草內生放線菌進行分離并研究了其對不同植物病原菌的抑菌活性，發現有幾株放線菌對多種病原菌都有很好的抑菌活性。研究表明，分離于秦嶺野生魚腥草根部的內生放線菌F03的發酵液對多種細菌、真菌均有很好的抑菌活性，特別是對金黃色葡萄球菌的抑菌效果尤為顯著。

鑒于此，作者以金黃色葡萄球菌為指示菌，采用單因素實驗和正交實驗對魚腥草內生放線菌F03培養基的碳源、氮源和發酵條件進行優化，并對發酵液抑菌活性物質進行初步研究，旨在提高該菌株抑菌活性物質的產量，擬為后續抑菌活性物質的開發奠定基礎。

1實驗

1.1菌種與培養基

金黃色葡萄球菌、魚腥草內生放線菌F03，陜西國際商貿學院醫藥學院微生物實驗室。

LB培養基：蛋白胨10 g、酵母粉 10 g、NaCl 5 g、蒸餾水1 000 mL，pH值7.2～7.4。

高氏一號培養基：可溶性淀粉20 g、KNO31 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL，pH值7.4～7.6。

基礎發酵培養基：葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、K2HPO40.3 g、NaCl 1 g、 CaCO32 g、蒸餾水1 000 mL。

1.2方法

1.2.1種子液的制備

將培養5 d的魚腥草內生放線菌F03用打孔器打成直徑5 mm的菌餅，放入裝有50 mL高氏一號發酵液的250 mL三角瓶中，每瓶放入3個菌餅。在30 ℃、搖床轉速150 r·min-1、pH值為7的條件下培養5 d，即得種子液。

1.2.2發酵液的制備

按5%的接種量將培養好的種子液無菌操作下轉接到裝有100 mL基礎發酵培養液的三角瓶中，在發酵液初始pH值為7、搖床轉速為150 r·min-1、30 ℃下振蕩培養9 d后，用布氏漏斗過濾，棄去菌體，即得發酵液。

1.2.3抑菌活性的測定

用直徑4 mm的打孔器在涂有金黃色葡萄球菌的培養皿中打2個菌孔，用移液槍吸取50 μL發酵液于菌孔中，在28 ℃培養箱中培養48～96 h，測量抑菌圈直徑。

1.2.4培養基碳源、氮源的篩選

(1)碳源的篩選

在基礎發酵培養基的基礎上，用蔗糖、葡萄糖、麥芽糖和可溶性淀粉作為培養基的碳源，其它成分保持不變。通過測量抑菌圈直徑，篩選出最佳碳源。

(2)氮源的篩選

在基礎發酵培養基的基礎上，用黃豆粉、酵母粉、蛋白胨和(NH4)2SO4作為培養基的氮源，其它成分保持不變。通過測量抑菌圈直徑，篩選出最佳氮源。

1.2.5最佳發酵條件的篩選

(1)發酵液初始pH值的篩選

在優化后的最佳培養基的基礎上，將發酵液初始pH值分別調至5、6、7、8、9、10，在30 ℃、搖床轉速150 r·min-1、接種量5%的條件下發酵培養9 d，得發酵液。測量發酵液的抑菌圈直徑，篩選出最佳發酵液初始pH值。

(2)發酵時間的篩選

按5%的接種量將種子液接入100 mL發酵液中，在篩選出的最佳發酵液初始pH值的基礎上，于30 ℃、搖床轉速150 r·min-1的條件下分別發酵培養5 d、7 d、9 d、11 d、13 d，得發酵液。測量發酵液的抑菌圈直徑，篩選出最佳發酵時間。

(3)發酵溫度的篩選

在篩選出的最佳發酵液初始pH值和發酵時間的基礎上，將發酵液分別在24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃下發酵培養，得發酵液。測量發酵液的抑菌圈直徑，篩選出最佳發酵溫度。

(4)搖床轉速的篩選

在篩選出的最佳條件下，將發酵液放入轉速分別為100 r·min-1、120 r·min-1、140 r·min-1、160 r·min-1、180 r·min-1的搖床內振蕩培養，得發酵液。測量發酵液的抑菌圈直徑，篩選出最佳搖床轉速。

(5)接種量的篩選

在篩選出的最佳條件下，分別按3%、5%、7%、9%、11%的接種量將種子液接入發酵培養液中培養，得發酵液。測量發酵液的抑菌圈直徑，篩選出最佳接種量。

1.2.6發酵液抑菌活性物質的研究

(1)抑菌活性物質熱穩定性的測定

將發酵液在60 ℃和100 ℃下分別放置60 min、120 min、180 min、240 min后，用蒸餾水調體積至原始體積。用打孔法分別測量發酵液的抑菌圈直徑，以未處理的發酵液為對照。

(2)抑菌活性物質酸堿穩定性的測定

將發酵液的pH值分別用1 mol·L-1HCl、1 mol·L-1NaOH調至1、3、5、7、9、11、13，靜置30 min、60 min、90 min后，再分別調發酵液的pH值到7，用打孔法測量發酵液的抑菌圈直徑，以未處理的發酵液為對照。

(3)發酵液Doskochilova溶劑系統紙層析

用移液槍取100 μL發酵液均勻點到距濾紙(10 cm×15 cm)邊緣10 mm處，再放入裝有展開劑的試管(12 mm×18 cm)中飽和20 min。將飽和的點樣濾紙的一邊浸沒于展開劑中約5 mm，待展開劑擴展到濾紙約10 cm處取出，自然晾干。將晾干的濾紙放入鋪有金黃色葡萄球菌的LB平板上，在28 ℃培養箱中培養48 h后，取出觀察抑菌圈位置，記錄Rf值。

2結果與討論

2.1培養基碳源、氮源的篩選

2.1.1碳源的篩選(圖1)

圖1　碳源對發酵液抑菌活性的影響

從圖1可看出，以葡萄糖作為碳源時，發酵液的抑菌活性最高，其次是蔗糖。說明，放線菌F03對葡萄糖和蔗糖的利用率高，更易合成活性產物。因此，選擇葡萄糖和蔗糖作為碳源。

2.1.2氮源的篩選(圖2)

從圖2可看出，以黃豆粉和蛋白胨作為氮源時，發酵液的抑菌活性最高。可能是因為，黃豆粉中除了有微生物需要的氮源外，還有一些其它有利于放線菌活性物質合成的復雜化合物。因此，選擇黃豆粉和蛋白胨作為氮源。

2.1.3碳源、氮源的正交實驗

根據單因素實驗篩選出的最佳碳源和氮源設計正交實驗，正交實驗的因素與水平見表1，正交實驗結果見表2。

圖2　氮源對發酵液抑菌活性的影響

表1正交實驗的因素與水平/%

Tab.1　Factors and levels of orthogonal experiment/%

表2正交實驗結果

Tab.2　Results of orthogonal experiment

從表2可看出，在7#的碳氮源配比下，發酵液的抑菌圈直徑最大，即抑菌活性最高。因此，放線菌F03的最適培養基為葡萄糖30 g、蔗糖10 g、黃豆粉10 g、蛋白胨10 g、K2HPO40.3 g、NaCl 1 g、CaCO32 g、蒸餾水1 000 mL。

2.2發酵條件的篩選

2.2.1發酵液初始pH值的篩選(圖3)

由圖3可知，發酵液初始pH值對發酵液的抑菌活性影響顯著。在酸性條件下不適合活性產物的合成，抑菌活性較低；在偏堿性條件下，抑菌活性較高，當發酵液初始pH值為8時，抑菌圈直徑最大。因此，發酵液的最佳初始pH值為8。

圖3　發酵液初始pH值對發酵液抑菌活性的影響

2.2.2發酵時間的篩選(圖4)

圖4　發酵時間對發酵液抑菌活性的影響

由圖4可知，隨著發酵時間的延長，活性代謝產物不斷增多，發酵液的抑菌活性不斷升高；到第7 d時，發酵液的抑菌活性達到最高；但隨著發酵時間的繼續延長，發酵液的抑菌活性呈下降趨勢，即代謝產物的活性不斷降低。因此，選擇7 d為最佳發酵時間，不僅可以節約成本，還可以提高活性產物含量。

2.2.3發酵溫度的篩選(圖5)

圖5　發酵溫度對發酵液抑菌活性的影響

由圖5可知，在24～32 ℃范圍內，發酵液抑菌活性先升高后降低，在28 ℃時達到最高。因此，選擇最佳發酵溫度為28 ℃。

2.2.4搖床轉速的篩選(圖6)

圖6　轉速對發酵液抑菌活性的影響

由圖6可知，搖床轉速對發酵液的抑菌活性有一定的影響。在搖床轉速為100 r·min-1時，發酵液的抑菌活性最低，可能是因為，微生物在合成活性代謝產物時需要大量氧氣，若搖床轉速太慢，所提供的氧氣量較少，不利于合成活性產物。隨著搖床轉速的加快，抑菌活性升高，但搖床轉速超過140 r·min-1后，繼續加快轉速，抑菌活性反而降低。因此，選擇最佳搖床轉速為140 r·min-1。

2.2.5接種量的篩選(圖7)

圖7　接種量對發酵液抑菌活性的影響

由圖7可知，若接種量太少，發酵液的抑菌活性較低，這是由于，菌體太少，產生的活性物質相應較少；隨著接種量的增加，抑菌活性先升高后降低，在7%時達到最高。這可能是由于，菌株量過多，大部分營養成分用于前期的菌體生長，以至于后期代謝產物的合成受到影響。因此，選擇最佳接種量為7%。

2.3發酵液抑菌活性物質的研究

2.3.1抑菌活性物質的熱穩定性(圖8)

圖8　抑菌活性物質的熱穩定性

由圖8可知，發酵液的抑菌活性物質在60 ℃和100 ℃下均比較穩定。雖然在100 ℃下放置一段時間后抑菌活性稍有下降，但總體來說，抑菌活性物質的熱穩定性較好。

2.3.2抑菌活性物質的酸堿穩定性(圖9)

圖9　抑菌活性物質的酸堿穩定性

由圖9可知，pH值對發酵液抑菌活性影響不大，發酵液的抑菌活性僅在pH值為1、3時稍低。因此，發酵液抑菌活性物質的酸堿穩定性較好。

2.3.3Doskochilova溶劑系統紙層析測定結果(圖10)

由圖10可看出，發酵液中抑菌活性成分在第5和第6溶劑系統，即正丁醇飽和的濃度為0.5 mol·L-1、pH值為7的磷酸緩沖液和正丁醇飽和的內含2%對甲基苯磺酸的水中的Rf值比較大，均在0.9左右。其它溶劑系統的Rf值都比較小，有的甚至為0。參照經典的抗生素紙色譜，初步推斷發酵液中的抑菌活性成分是一種大極性的水溶性抗生素。

圖10發酵液的Doskochilova溶劑系統的Rf值

Fig.10TheRfvalues of the fermentation broth in Doskochilova solvent system

3結論

通過單因素實驗和正交實驗確定了魚腥草內生放線菌F03的最佳培養基為：葡萄糖30 g，蔗糖10 g，黃豆粉10 g，蛋白胨10 g，K2HPO40.3 g，NaCl 1 g，CaCO32 g，蒸餾水1 000 mL。最佳發酵條件為：發酵液初始pH值8，發酵時間7 d，發酵溫度28 ℃，搖床轉速140 r·min-1，接種量7%。發酵液抑菌活性物質的熱穩定性和酸堿穩定性較好，發酵液中的抑菌活性成分是一種大極性的水溶性抗生素。

參考文獻：

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[6]楊春平,寇陽,謝婷,等.魚腥草內生放線菌的分離及殺菌活性研究[J].安徽農業科學,2010,38(18):9584-9586.

Optimization of Fermentation Conditions forEndophyticActinomyceteF03 fromHouttuyniaCordataand Preliminary Study on Antibacterial Active Substances

YU Zhe,ZHANG Shuang

(CollegeofPharmacy,ShaanxiInstituteofInternationalTrade&Connerce,Xianyang712000,China)

Abstract：F03 is an Endophytic actinomycete with strong antibacterial activity,which was separated from Qinling Mountains wild Houttuynia cordata root.Using S.aureus as an indicator bacterium,single factor experiment and orthogonal experiment were used to optimize the carbon source,nitrogen source of the medium and fermentation conditions.The antibacterial active substances of the fermentation broth was studied.The optimal culture medium was as follows:glucose 30 g,sucrose 10 g,soybean powder 10 g,peptone 10 g,K2HPO4 0.3 g,NaCl 1 g,CaCO3 2 g,distilled water 1 000 mL.The optimal fermentation conditions were as follows:initial pH value of fermentation broth 8,fermentation time 7 d,fermentation temperature 28 ℃,shaking speed 140 r·min-1,inoculum 7%.The antibacterial active substances had good thermal stability and acid-base stability.The results of paper chromatography of Doskochilova solvent systems showed the main antibacterical active substance to S.aureus was water-soluble metabolite.

Keywords：Endophytic actinomycete;optimal culture medium;fermentation condition;optimization;Houttuynia cordata;antibacterial active substance

中圖分類號：TQ 920.6

文獻標識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)02-0050-05

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.02.011

作者簡介：于哲(1989-)，女，陜西三原人，助教，研究方向：天然藥物化學，E-mail：529741506@qq.com。

收稿日期：2015-11-02