HPLC法測定印度黃檀中黃檀素等3種成分含量

李然，林勵，祁龍凱，杜海芳，李靜，蔡聰，鄭來安，葉耀祥

(1.廣州中醫藥大學 中藥學院，廣東 廣州 510006； 2.廣東省湛江南藥試驗場，廣東 遂溪 524338； 3.廣東中檀實業有限公司，廣東 臺山 529200)

?

HPLC法測定印度黃檀中黃檀素等3種成分含量

李然1，林勵1，祁龍凱1，杜海芳1，李靜1，蔡聰2，鄭來安2，葉耀祥3

(1.廣州中醫藥大學 中藥學院，廣東 廣州 510006； 2.廣東省湛江南藥試驗場，廣東 遂溪 524338； 3.廣東中檀實業有限公司，廣東 臺山 529200)

摘要:目的 建立印度黃檀中黃檀素、黃檀素甲醚和4-甲氧基黃檀醌的質量分數測定方法。方法 色譜柱為Waters Symmetry C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇-0.2 %(體積分數)H3PO4水溶液；梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，黃檀素、黃檀素甲醚、4-甲氧基黃檀素檢測波長分別為260、254、280 nm。結果 黃檀素、黃檀素甲醚、4-甲氧基黃檀醌的平均回收率分別為98.24%、99.66%、99.06%，RSD值分別為1.57%、0.98%、1.29%。國內引種印度黃檀中黃檀素、黃檀素甲醚、4-甲氧基黃檀醌質量分數范圍分別為0.756%～2.347%、0.059%～0.349%、0.047%～1.240%。結論 本方法簡便、準確，重復性、穩定性好，可用于印度黃檀中黃檀素、黃檀素甲醚和4-甲氧基黃檀醌的質量分數測定。

關鍵詞:印度黃檀； 高效液相色譜法； 黃檀素； 黃檀素甲醚； 4-甲氧基黃檀醌

印度黃檀DalbergiasissooRoxb.為豆科黃檀屬(Dalbergia)落葉半落葉大喬木，原產于印度、尼泊爾、巴基斯坦、孟加拉國、巴西、馬達加斯加等國[1]，我國主要引種于廣東、廣西、云南等地，被列為QB/T2385-200X《深色名貴硬木家具》中的紅酸枝木類[2]。印度黃檀為中藥降香原植物降香檀D.odorifera同屬植物，其心材曾進口作為降香藥材使用，即《本草綱目》木部降真香所載“俗呼舶上來者為番降”中的番降，具有化瘀止血、理氣止痛功效[3]。該植物生長迅速，尤其在生長初期，株高及胸徑一般可達同齡降香檀的2倍左右，種植5年生的印度黃檀一般就能形成心材，10～15 a基本成材[4]。

印度黃檀心材主要含揮發油和黃酮類成分[5-6]，其主要成分黃檀素(黃檀內酯)具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化[7]等生物活性，對離體兔心有顯著增加冠脈流量、減慢心率、輕度增加心跳幅度的作用[8]，對兔血漿有微弱的抗凝作用[9]；4-甲氧基黃檀醌則表現出顯著的抗感染活性[10]。

迄今為止尚鮮見對印度黃檀中黃檀素等成分質量分數測定的報道。為此，本文對國內引種的印度黃檀中黃檀素、黃檀素甲醚和4-甲氧基黃檀醌進行質量分數測定，以期為該藥材的質量評價及產品開發利用提供參考依據。

1儀器與試藥

1.1儀器

E2695型高效液相色譜儀(2998檢測器，Empower3軟件，美國Waters公司)；BP 211D型電子分析天平(十萬分之一，瑞士Sartorious公司)；XS 225A型電子分析天平(萬分之一，瑞士Precisa公司)；KQ500型超聲波清洗器(功率500 W，頻率40 kHz，昆山超聲儀器有限公司)。

1.2試藥

印度黃檀各樣品經廣州中醫藥大學林勵研究員鑒定為豆科植物印度黃檀D.sissooRoxb.的心材，其來源見表1；黃檀素、黃檀素甲醚和4-甲氧基黃檀醌對照品均為自制(經面積歸一化法計算質量分數均大于98%)；甲醇 (德國Merck公司，色譜純)；乙腈 (德國Merck公司，色譜純)；H3PO4(天津科密歐化學試劑有限公司，色譜純)；水為純凈水；其他試劑均為分析純。

2方法

2.1混合對照品溶液的制備

分別取黃檀素、黃檀素甲醚、4-甲氧基黃檀醌對照品適量，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，溶解，搖勻，得黃檀素、黃檀素甲醚、4-甲氧基黃檀醌質量濃度分別為0.764、0.868、0.892 mg/mL的對照品溶液。上述3種對照品溶液各取1 mL混合，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

表19批印度黃檀的來源信息表

Table 1The information of 9 batches ofDalbergiasissooRoxb. samples

編號產地生長年限/aS1廣東省湛江南藥試驗場40S2云南省紅河州14S3云南省玉溪市元江熱帶林科所12S4云南省玉溪市12S5云南省紅河州8S6廣東省湛江南藥試驗場6S7廣東省江門市開平縣百合鎮5S8廣東省江門市開平縣百合鎮4S9廣東省梅州市3

2.2供試品溶液的制備

取印度黃檀干燥心材，粉碎(過2號藥篩)，稱取約0.5 g，精密稱定，準確加入甲醇50 mL，稱定質量。超聲提取30 min，補足質量，搖勻。用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3檢測波長的選擇

在210～400 nm全波長掃描S1供試品溶液發現黃檀素在260 nm有較強吸收，黃檀素甲醚在254 nm有較強吸收峰，4-甲氧基黃檀醌在280 nm有較強吸收峰，故分別采用260、254、280 nm為測定波長。

2.4色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry ODS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.2%(體積分數，下同)H3PO4水溶液，梯度洗脫條件見表2。流速：1 mL/min；檢測波長：0～23 min為260 nm，23～27 min為254 nm，27～52 min為280 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。分別精密吸取混合對照品、供試品溶液 10 μL進樣，按上述條件測定，所得圖譜見圖1。

表2印度黃檀中3種成分的梯度洗脫條件

Table 2Gradient elution program in the determinations of 3 constituents from ofDalbergiasissooRoxb.

t/minφ(甲醇)/%φ(0.2%H3PO4)/%03070156040306139451000491000503070523070

231123AB0.250.200.150.100.050.000.150.100.050.00AU05101520253035404550t/minAU

1.黃檀素； 2.黃檀素甲醚； 3. 4-甲氧基黃檀醌。

圖1混合對照品(A)、供試品(B)溶液的HPLC色譜圖

Figure 1HPLC chromatograms of reference substances(A)and test sample(B)

2.5線性關系的考察

分別精密吸取對照品溶液1、2、3、4、5、10 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，按“2.4”項下色譜條件進樣分析，分別以各成分質量濃度(ρ)對峰面積(A)進行線性回歸，所得回歸方程及線性范圍見表3。

2.6精密度試驗

精密吸取對照品溶液10 μL，連續進樣5次，按“2.4”項下色譜條件測定并計算，結果黃檀素、黃檀素甲醚、4-甲氧基黃檀醌峰面積的RSD值分別為2.32%、1.66%、2.76%。

表3　黃檀素、黃檀素甲醚和4-甲氧基黃檀醌的回歸方程

2.7穩定性試驗

取印度黃檀樣品(S1)約0.5 g，精密稱定，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，室溫放置，在0、2、4、6、8、10 h分別進樣，按“2.4”項下色譜條件連續測定6次，結果黃檀素、黃檀素甲醚、4-甲氧基黃檀醌峰面積的RSD值分別為0.84%、1.48%、2.28%。表明供試品溶液室溫放置10 h內基本穩定。

2.8重復性試驗

取印度黃檀樣品(S1)0.5 g，精密稱定，平行操作5份。分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件測定。結果黃檀素、黃檀素甲醚、4-甲氧基黃檀醌峰面積的RSD值分別為1.88 %、0.35%、0.71%，表明方法重復性良好。

2.9加樣回收率試驗

稱取已知質量分數的S1號印度黃檀樣品6份，每份約0.1 g，每2份為1組，精密稱定，每組分別準確加入新配置的黃檀素、黃檀素甲醚和4-甲氧基黃檀醌質量濃度分別為0.764、0.868、0.892 mg/mL的混合對照品溶液1、2、3 mL，加甲醇至10 mL，稱定質量，超聲提取30 min，補足質量，搖勻。分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件測定，計算回收率及其RSD值。結果如表4～表6所示，表明本方法加樣回收率良好。

2. 10樣品的測定

取9批不同來源印度黃檀心材，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，每批制備3份，按“2.4”項下色譜條件測定，根據標準曲線及峰面積計算各成分質量分數，結果見表7。

表4印度黃檀中黃檀素的加樣回收率試驗結果

Table 4Recovery results of dalbergin inDalbergiasissooRoxb. (n=6)

樣品量/mg樣品中的量/mg加入量/mg測得量/mg回收率/%100.9141.9010.7642.64196.843100.1551.8870.7642.652100.181101.2421.9071.5283.42299.123100.9601.9021.5283.38997.318100.8821.9012.2924.11296.491100.9421.9022.2924.18199.453平均回收率=98.24%,RSD=1.57%

表5印度黃檀中黃檀素甲醚的加樣回收率試驗結果

Table 5Recovery results ofO-methyldalbergin inDalbergiasissooRoxb. (n=6)

樣品量/mg樣品中的量/mg加入量/mg測得量/mg回收率/%100.8820.3520.8681.220100.003100.9420.3520.8681.231101.257101.2420.3531.7362.08199.526100.9600.3521.7362.07199.012100.9140.3522.6042.95199.805100.1550.3502.6042.91198.374平均回收率=99.66%,RSD=0.98%

表6印度黃檀中4-甲氧基黃檀醌的加樣回收率試驗結果

Table 6 Recovery results of 4-methoxydalbergione inDalbergiasissooRoxb. (n=6)

樣品量/mg樣品中的量/mg加入量/mg測得量/mg回收率/%101.2420.7180.8921.58196.782100.9600.7160.8921.610100.268100.8820.7151.7842.48999.442100.9420.7161.7842.47198.398100.8860.7152.6763.38999.905100.9410.7162.6763.38099.556平均回收率=99.06%,RSD=1.29%

表79批印度黃檀中黃檀素、黃檀素甲醚和4-甲氧基黃檀醌的質量分數測定結果

Table 7 Determination results of dalbergin,O-methyldalbergin and 4-methoxydalbergione inDalbergiasissooRoxb.

w/%

3討論

通過測定9批印度黃檀樣品得知，國內引種印度黃檀中主要有效成分黃檀素質量分數較高，在0.756%～2.347%范圍內，其中以湛江引種的印度黃檀S1、S6中黃檀素質量分數較高且比較穩定，云南引種印度黃檀S2～S5中黃檀素質量分數差異較大。黃檀素甲醚質量分數范圍為0.059%～0.326%，以S1、S6質量分數最高。4-甲氧基黃檀醌質量分數范圍為0.047%～1.240%，在S2～S5中質量分數最低，以S7、S8和S9(生長年限分別為5、4和3 a)為高，提示在樹齡較低的印度黃檀中4-甲氧基黃檀醌質量分數較高，隨著樹齡增加此成分長較慢。由此可見,印度黃檀的生長環境、栽培條件、生長年限等因素對其化學成分影響較大。

本文采用HPLC法測定了印度黃檀中3種成分的質量分數，該法靈敏度高，簡單、快速，能準確有效地測定印度黃檀化學成分、尤其是主要有效成分黃檀素的質量分數，為建立印度黃檀的質量控制標準奠定了良好的基礎。

參考文獻:

[1] TEWARI D N. A monograph onDalbergiasissooRoxb.[M]. Dehradun: International Book Distributors,1994.

[2] 王小芳.深色名貴硬木家具用材研究[D].南寧:廣西大學,2008:17.

[3] 中藥商品知識編寫組.中藥商品知識:中冊[M].廣州:廣東科技出版社,1989:157.

[4] 石雷,梁英揚,鄧疆.印度黃檀引種試驗研究[J].西南農業學報,2010,23(2):559-559.

[5] 林勵,徐鴻華,肖省娥,等.不同品種降香質量研究[J].中藥材,1997,20(7):366-370.

[6] 肖省娥,林勵.不同來源的降香藥材中總黃酮含量測定[J].基層中藥雜志,2000,14(6):12-14.

[7] KAWAII S,TOMONOY,KATASE E,et al.Effect of coumarins on HL-60 cell differentitation [J].Anticancer Res,2000,20(4):2505-2512.

[8] 朱亮,冷紅文,譚力偉,等.降香揮發油對血栓形成、血小板 cAMP 和血漿纖溶酶活性的影響[J].中成藥,1992,14(4):30.

[9] 訾慧，沙明.中藥降香研究進展[J].遼寧中醫學院學報,2003,5(2):90-91.

[10] CHAN S C,CHANG Y S,WANG J P,et al.Three new flavonoids and antiallergic,anti-inflammatory constituents from the heartwood of Dalbergia odorifer[J].Planta Med,1998,64(2):153-158.

(責任編輯：劉曉涵)

Quantitative determination of dalbergin and other two compounds inDalbergiasissooRoxb. by HPLC

LI Ran1,LIN Li1,QI Longkai1,DU Haifang1,LI Jing1,CAI Cong2,ZHENG Lai′an2,YE Yaoxiang3

(1.SchoolofChineseHerbalMedicine,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China; 2.ZhanjiangSouthMedicineFieldTestingGround,Suixi524338,China; 3.ZhongtanIndustrialCo.,LTDinGuangdong,Taishan529200,China)

Abstract:Objective To establish an HPLC method for the quantitative determination of dalbergin,O-methyldalbergin and 4-methoxydalbergione in Dalbergia sissoo Roxb.Methods The separation was performed on Waters Symmetry C18column (250 mm×4.6 mm,5 μm) eluted with a mobile phase of methanol-0.2% phosphoric acid solution in a gradient elution. The detection wavelength of dalbergin,O-methyldalbergin and 4-methoxydalbergione were 260,254 and 280 nm,respectively.Results The average recoveries of dalbergin,O-methyldalbergin and 4-methoxydalbergione were 98.24%,99.66%,and 99.06%,with RSD of 1.57%,0.98% and 1.29%,respectively. The contents of dalbergin,O-methyldalbergin and 4-methoxydalbergione were in the range of 0.756%-2.347%,0.059%-0.349%,and 0.047%-1.240% in the introduced Dalbergia sissoo Roxb.Conclusion The HPLC method is accurate and reproducible for the quantitative determinations of dalbergin,O-methyldalbergin and 4-methoxydalbergione in Dalbergia sissoo Roxb.

Key words:Dalbergia sissoo Roxb.; HPLC; dalbergin; O-methyldalbergin; 4-methoxydalbergione

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015102101

中圖分類號:R284.1

文獻標志碼：A

文章編號:1006-8783(2016)01-0051-04

作者簡介：李然(1985—)，男，2013級博士生，從事中藥資源開發與新藥研發，Email:wwwlr@163.com；通信作者：林勵(1954—)，男，研究員，博士生導師，從事中藥資源開發與新藥研發，Email：LL76611@126.com。

收稿日期：2015-10-21

網絡出版時間：2016-01-15 18:33網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160115.1833.009.html