龍須藤總黃酮中5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮在大鼠體內的藥動學研究

楊俊騰，周毅生，莫海珊，吳曉敏

(廣東藥學院 中藥學院，廣東 廣州 510006)

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龍須藤總黃酮中5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮在大鼠體內的藥動學研究

楊俊騰，周毅生，莫海珊，吳曉敏

(廣東藥學院 中藥學院，廣東 廣州 510006)

摘要:目的 建立測定大鼠血漿中5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮濃度的HPLC法，并研究其藥動學行為。方法 2組大鼠分別灌胃給予龍須藤總黃酮(給藥劑量為60 mg/kg)和5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮(給藥劑量為113 mg/kg)，采用高效液相色譜法測定血漿中5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮的濃度，以軟件DAS 2.0計算藥動學參數。結果 大鼠灌胃5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮和龍須藤總黃酮后，5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮的體內過程均符合單室模型，主要藥動學參數如下：AUC0～∞分別為(5.502±1.302)、(4.192±0.232) (mg·h)/L，Cmax分別為(0.689±0.065)、(0.758 ±0.157) mg/L，Tmax分別為(3.111±0.434)、(1.430±0.365) h，T1/2分別為(2.444±0.287)、(2.700±0.890) h。結論 以小劑量龍須藤總黃酮給藥較單體給藥時5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮血藥濃度峰值高，吸收速率常數大，達峰時間短，龍須藤總黃酮中共存的其他成分可能有促進5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮吸收的作用。

關鍵詞:龍須藤總黃酮； 5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮； 藥動學； 大鼠

龍須藤為豆科蘇木亞科羊蹄甲屬植物龍須藤Bauhiniachampionii(Benth.) Benth.的干燥藤莖，別名過崗園龍、九龍藤、梅花入骨丹等，主要分布于廣東、廣西、福建等省區，收載于《廣東省中藥材標準》，味苦、澀，性平，能祛風除濕、活血止痛、健脾理氣等[1]。關于龍須藤的提取純化與質量標準的研究已有相關報道[2-4]。大量研究表明，龍須藤具有抗感染、鎮痛、抗癌等生物活性，其中龍須藤總黃酮在抗感染、抗類風濕性關節炎方面有良好的活性[5-9]。從龍須藤藥材中分離的5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮具有抗癌、鎮痛抗感染作用[10-11]。關于龍須藤總黃酮中5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮在大鼠體內的藥動學行為未見文獻報道，本文旨在對比研究龍須藤總黃酮中5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮和單體5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮在大鼠體內的藥動學行為，為闡明5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮的藥動學特征提供依據。

1儀器與材料

1.1儀器

1.2藥品與試劑

5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮(批號：111765-200601，質量分數98%，中國食品藥品檢定研究院)；龍須藤總黃酮(自制，質量分數98%)；淫羊藿苷(批號：110737-200415，質量分數98%，中國食品藥品檢定研究院)；乙腈、甲醇(色譜級，瑞典Oceanpak公司)；蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

1.3動物

SPF級SD大鼠12只，雌雄各半，體質量200～250 g，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(粵)2013-0020。

2方法與結果

2.1龍須藤總黃酮的提取與分離[6]

取龍須藤藥材10 kg，粉碎，按藥材與提取溶劑比為1∶10(kg∶L)，加體積分數70%乙醇100 L，回流提取3次，每次2 h，合并提取液后減壓回收乙醇至無醇味，將回收乙醇后的水溶液用同倍量乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯層，減壓回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯干浸膏720 g。取乙酸乙酯干浸膏55 g，采用硅膠柱層析，上樣量與硅膠量比為1∶10(g∶g)，采用二氯甲烷-乙酸乙酯(體積比8∶1～4∶1)梯度洗脫，TLC跟蹤分析，合并相同部位，得龍須藤總黃酮1.0 g。經HPLC測定，5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮質量分數為24.0%，3′,4′-亞甲二氧基-5,5,6,7-四甲氧基黃酮質量分數為14.6%，5,6,7,3′,4′,5′-六甲氧基黃酮質量分數為28.0%，3者總質量分數達66.6%。

國內也有一些研究：劉誠等（2012）從老鄉、校友、共同工作經歷衡量獨立董事和 CEO 的社會關系，并發現這些關系與董事會的獨立性正相關；陸瑤等（2016）重點考察了獨立董事與CEO之間的老鄉關系對公司違規的影響；李維安等（2017）從董事會成員與CEO之間的老鄉、工作、校友關系、年齡和性別相似度度量董事會的社會獨立性，發現董事會社會獨立性越高，違規公司的CEO越容易發生變更。

2.2溶液的配制

2.2.1對照品溶液的制備精密稱取5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮9.72 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，吸取1 mL和0.1 mL分別置于2個100 mL容量瓶中，加甲醇定容，配成質量濃度為9.72 mg/L和0.972 mg/L的對照品溶液。

2.2.2內標溶液的制備精密稱取淫羊藿苷11.3 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，吸取1 mL置于100 mL容量瓶中，甲醇定容，配成質量濃度為11.3 mg/L的淫羊藿苷對照品溶液。

2.2.3藥液的配制分別稱取龍須藤總黃酮98 mg和5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮183 mg，以質量分數10%丙二醇生理鹽水溶液配制成質量濃度為8.16 mg/mL的龍須藤總黃酮混懸液和質量濃度為7.62 mg/mL的5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮混懸液，使用前充分搖勻。

2.3色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(0～10 min，30%～40%乙腈；10～26 min，40%～48%乙腈；26～30 min，48%～30%乙腈；30～40 min，30%乙腈)；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：326 nm；進樣量：50 μL。

2.4血漿樣品的處理方法

取離心得到的血漿200 μL，加入質量濃度為11.3 mg/L的淫羊藿苷內標10 μL，渦旋混合3 min，加入乙腈600 μL，渦旋混合3 min，以12 000 r/min離心20 min，取上清液，50 ℃、N2吹至約100 μL，加乙酸乙酯400 μL，渦旋1 min，靜置后以3 000 r/min離心5 min，取乙酸乙酯層，50 ℃、N2吹干，殘渣加甲醇200 μL復溶，12 000 r/min離心10 min，0.22 μm微孔濾膜濾過，取50 μL進樣分析。

2.5方法學考察

2.5.1專屬性考察取空白血漿，不加內標溶液，其余按“2.4”項下方法操作，色譜圖見圖1-A；空白血漿加5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮對照品，按“2.4”項下方法操作，色譜圖見圖1-B(其中5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮對照品的質量濃度為0.486 0 mg/L，淫羊藿苷的質量濃度為0.565 0 mg/L)；大鼠灌胃給藥5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮1 h后，按“2.4”項下方法操作，色譜圖見圖1-C；大鼠灌胃給予龍須藤總黃酮30 min后，按“2.4”項下方法操作，色譜圖見圖1-D。可見：該色譜條件下，能同時檢測5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮和內標物淫羊藿苷，淫羊藿苷和5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮的保留時間分別為10 min和22.5 min，按5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮計算理論塔板數大于40 000，與血漿內源性物質及龍須藤總黃酮中其他成分分離良好，分離度大于1.5。

151050mAU1020300122.50.0-2.5-5.01221101520253035052.50.0-2.5-5.0-7.510152025303505101520253035055.02.50.0-2.5-5.0mAUmAUmAUt/minACBD

A.空白血漿； B.空白血漿加淫羊藿苷(0.565 0 mg/L)和5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮(0.486 0 mg/L)； C.灌胃5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮后血漿樣品； D.灌胃龍須藤總黃酮后血漿樣品； 1.淫羊藿苷； 2.5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮。

圖1血漿中5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮的色譜圖

Figure 1Chromatograms of 5,7,3′,4′,5′-pentamethoxyflavone in plasma

2.5.2標準曲線的制備分別取質量濃度為0.972 mg/L的對照品溶液10、20、40、100、200 μL以及質量濃度為9.72 mg/L的對照品溶液40、50 μL，吹干溶劑，再分別加入空白血漿200 μL，配成質量濃度為0.048 6、0.097 2、0.194 4、0.486 0、0.972 0、1.944 0、2.430 0 mg/L的標準血漿樣品。除“取離心得到的血漿200 μL”外，其余按“2.4”項下方法操作。以質量濃度為橫坐標，5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮與淫羊藿苷的峰面積之比為縱坐標，得回歸方程Y=6.512X+0.136 6，r=0.999 3，線性范圍為0.048 6～2.430 0 mg/L。以S/N>10為定量限。

2.5.3精密度試驗按“2.5.2”項下方法配制5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮低、中、高3個質量濃度(0.097 2、0.486 0、1.944 0 mg/L)的標準血漿樣品，每個質量濃度平行5份，除“取離心得到的血漿200 μL”外，其余按“2.4”項下方法操作。各濃度于1日測定5次，計算日內精密度；連續測定3 d，計算日間精密度，結果見表1。表明低、中、高3個質量濃度樣品的精密度試驗結果RSD均小于15%。

表15,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮的精密度試驗結果

ρ/(mg·L-1)日內精密度ρ/(mg·L-1)RSD/%日間精密度ρ/(mg·L-1) RSD/%0.09720.1061±0.00827.70.1001±0.013813.80.48600.4830±0.01653.40.4636±0.01854.01.94401.9228±0.08634.41.9290±0.06103.1

2.5.4回收率試驗按“2.5.2”項下方法制備5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮低、中、高3個質量濃度(0.097 2、0.486 0、1.944 0 mg/L)的標準血漿樣品，每個質量濃度平行5份，除“取離心得到的血漿200 μL”外，其余按“2.4”項下方法操作。由標準曲線計算5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮的實測質量濃度，以實測質量濃度與配制質量濃度之比計算方法回收率。結果5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮低、中、高質量濃度的方法回收率分別為(109.2±8.4)%、(99.3±3.4)%、(95.8±5.2)%。

按“2.5.2”項下方法制備5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮低、中、高3個質量濃度(0.097 2、0.486 0、1.944 0 mg/L)的標準血漿樣品，每個質量濃度平行5份，除“取離心得到的血漿200 μL”外，其余按“2.4”項下方法操作。同時，配制相同質量濃度的不含血漿的對照品和內標物溶液，按“2.3”項下色譜條件分析。以血漿樣品中對照品與內標物峰面積比與相同質量濃度不含血漿的對照品和內標物溶液直接進樣所得的峰面積比比較，計算提取回收率，結果5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮低、中、高質量濃度的提取回收率分別為(75.7±5.7)%、(79.4±8.1)%、(78.9±3.9)%。

2.5.5穩定性試驗按“2.5.2”項下方法制備5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮低、中、高3個質量濃度(0.097 2、0.486 0、1.944 0 mg/L)的標準血漿樣品，每個質量濃度平行3份，分別于4 ℃放置24 h，-20 ℃放置5 d，反復凍融3次后，除“取離心得到的血漿200 μL”外，其余按“2.4”項下方法操作。以標準曲線計算濃度，結果見表2。表明低、中、高3個質量濃度樣品的穩定性試驗RSD均小于15%。

表2　5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮的穩定性試驗結果

2.6藥動學研究

健康SD大鼠12只，雌雄各半，隨機分為2組，適應性飼養1周，給藥前12h禁食不禁水。Ⅰ組灌胃5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮，劑量為113mg/kg，Ⅱ組灌胃龍須藤總黃酮，劑量為60mg/kg(以5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮算為14.4mg/kg)。Ⅰ組于給藥后30min，1、1.5、2、4、6、8、10、12、24h，Ⅱ組于給藥后5、15、30min，1、1.5、2、4、6、8、12、24h，分別從眼球后靜脈叢取血0.5mL，置于肝素抗凝管中，以6 000r/min離心10min得血漿。按“2.4”項下方法操作，測定各血漿樣品中的5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮的質量濃度。在測定樣品過程中，按“2.5.2”項下方法制備5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮低、中、高3個質量濃度(0.097 2、0.486 0、1.944 0mg/L)的質控血漿樣品，除“取離心得到的血漿200μL”外，其余按“2.4”項下方法操作，每日進行質控。

2.6.1藥動學參數龍須藤總黃酮中5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮及單體5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮的平均血藥質量濃度-時間曲線見圖2，血藥質量濃度數據采用DAS2.0軟件計算主要藥動學參數，結果見表3。5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮的血藥質量濃度-時間數據擬合符合單室模型。

1.00.80.60.40.201015202530055,7,3′,4′,5′五甲氧基黃酮組龍須藤總黃酮組t/hρ/(mg?L-1)

圖25,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮的平均血藥質量濃度-時間曲線

表35,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮的主要藥動學參數

參數龍須藤總黃酮組5,7,3',4',5'-五甲氧基黃酮組Cmax/(mg·L-1)0.758±0.1570.689±0.065Tmax/h1.430±0.3653.111±0.434T1/2/h2.700±0.8902.444±0.287AUC0～t/(mg·h·L-1)4.162±0.2315.390±1.214AUC0～∞/(mg·h·L-1)4.192±0.2325.502±1.302k/h-10.289±0.1310.287±0.034ka/h-11.606±0.8010.369±0.058

2.6.2相對生物利用度根據以下公式計算相對生物利用度[12]：

式中：F為相對生物利用度，AUCT、AUCR分別為龍須藤總黃酮組和5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮組的時間曲線下面積，XT為龍須藤總黃酮組的給藥劑量(60 mg/kg，以5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮計為14.4 mg/kg)，XR為5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮組的給藥劑量(113 mg/kg)。計算得到5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮的相對生物利用度為581%。

3討論

本文采用HPLC-UV法測定血漿中5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮的濃度，結果表明5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮在326 nm處有最大吸收，峰形好，基線穩定，故選取326 nm為檢測波長，所選內標物淫羊藿苷能與龍須藤總黃酮中的其他成分及血漿內源性成分達到很好的分離。在本文色譜條件下，龍須藤總黃酮中的5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮與相鄰組分的分離度均大于1.5，按5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮計算理論塔板數不低于40 000，表明該法靈敏、準確。

根據本課題組前期5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮的抗炎鎮痛試驗[11]，小鼠給藥劑量折算成大鼠的給藥劑量為0.028 4、0.056 8、0.113 6 g/kg，以5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮計龍須藤總黃酮的給藥劑量為0.118、0.236、0.473 g/kg。經過反復試驗，給予5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮單體低、中劑量，其血藥質量濃度過低，難以得到完整的血藥質量濃度-時間曲線，故采用0.113 g/kg為給藥劑量。龍須藤總黃酮給予所折算的低劑量即可造成大鼠死亡，原因可能為龍須藤總黃酮中除含有5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮外，尚含有類似結構的5種多甲氧基黃酮成分[13]，其中或存在毒性較大的成分，使得給予與單體給藥時同等劑量的情況下造成大鼠死亡，難以進行等劑量的比較，故將劑量降為0.06 g/kg，則獲得圖2血藥質量濃度-時間曲線。

由DAS2.0軟件擬合結果所得藥動學參數可知，以龍須藤總黃酮給藥時，其中的5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮比單體給藥的血藥質量濃度峰值高，達峰時間短，吸收速率常數大，原因可能是5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮為多甲氧基黃酮，結構中沒有羥基等親水基團，在水溶液為主的胃腸道中難以溶解，吸收過程受到溶解度的限制。單體給藥可能因在胃腸道中溶解性差而導致吸收緩慢，而以龍須藤總黃酮給藥時，可能因混合物中含有的其他多甲氧基黃酮或其他成分可促進5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮的溶解，使得5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮吸收加快，導致達峰時間變短，達峰濃度值升高。5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮單體給藥劑量約為龍須藤總黃酮所含5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮的7.8倍，但是兩者的藥時曲線下面積相差不大，原因可能為龍須藤總黃酮中的其他成分促進5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮的吸收，而單體給藥時，由于吸收差導致吸收進血的量減少，從而使得龍須藤總黃酮中5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮的相對生物利用度升高。

據此推測，龍須藤總黃酮中存在的類似結構成分或其他類成分可能具有促進5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮的吸收的作用。為全面了解5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮的體內動力學行為，尚需進一步進行體內分布研究。

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(責任編輯：陳翔)

Study on the pharmacokinetics of 5,7,3′,4′,5′-pentamethoxyflavone in total flavonoids fromBauhiniachampionii(Benth.) Benth. in rats

YANG Junteng,ZHOU Yisheng,MO Haishan,WU Xiaomin

(SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006，China)

Abstract:Objective To develop a HPLC method for the determination of 5,7,3′,4′,5′-pentamethoxy-flavon in rat plasma and study pharmacokinetics of 5,7,3′,4′,5′-pentamethoxyflavone in total flavonoids from Bauhinia championii (Benth.) Benth. in rats after intragastric administration. Methods The two groups of rats were orally treated with total flavonoids from B. championii (the dose was 60 mg/kg) and 5,7,3′,4′,5′-pentamethoxyflavon (the dose was 113 mg/kg). The concentration of 5,7,3′,4′,5′-pentamethoxyflavon in plasma was determined by HPLC. The pharmacokinetic parameters were calculated with DAS 2.0 program. Results Metabolic process of 5,7,3′,4′,5′-pentamethoxyflavon was fit with single compartment model after intragastric administration. The main pharmacokinetic parameters were as follows: AUC0～∞were (5.502±1.302) (mg·h)/L and (4.192±0.232) (mg·h)/L，Cspanwere (0.689±0.065) mg/L and (0.758±0.157) mg/L，Tspanwere (3.111±0.434) h and (1.430±0.365) h，T1/2were (2.444±0.287) h and (2.700±0.890) h. Conclusion When small dose of total flavonoids from B. championii was administered,the Cspanwas higher,the absorption rate constant was bigger,and the Tspanwas shorter than those of monomer administration. Other ingredients of total flavonoids from B. championii can promote the absorption and change the distribution of 5,7,3′,4′,5′-pentamethoxyflavon.

Key words:total flavonoids from Bauhinia championii (Benth.) Benth.; 5,7,3′,4′,5′-pentamethoxyflavone; pharmacokinetics; rat

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015110501

中圖分類號:R965

文獻標志碼:A

文章編號:1006-8783(2016)01-0009-05

作者簡介：楊俊騰(1990—)，女，2013級碩士研究生，Email:yjt060913@126.com；通信作者：周毅生(1957—)，男，教授，碩士生導師，從事藥物新劑型及新技術研究，電話:020-39352168,Email:yishzhou@aliyun.com。

收稿日期：2015-11-05

網絡出版時間：2016-01-18 10:03網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160118.1003.003.html