棉花枯萎病菌拮抗內生菌的篩選和拮抗效果檢測崔

崔鄭龍++柴秀娟++孔德真+王愛英

摘要：從甘草、阿魏、苦豆子中篩選出4株對棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium）抑制效果較好的內生菌，通過其生理生化檢測、16S rDNA序列分析進行鑒定；選擇抑菌效果最好的拮抗菌A，分別測定其胞內、胞外分泌物的抑菌效果，并檢測該菌株對棉花種子萌發和活性氧酶系統的影響。結果表明，拮抗菌A為解淀粉枯草芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），其胞內分泌物對枯萎病菌菌絲生長、產孢、孢子萌發的平均抑制率均高于胞外分泌物。拮抗菌A處理棉花可提高其成活率，但不引起植株系統誘導抗性。拮抗菌A的主要抑菌物質存在于細胞內，抑制產孢是其主要拮抗途徑。

關鍵詞：棉花枯萎病菌；拮抗菌；胞外分泌物；胞內分泌物；抑菌效果

中圖分類號： S435.621.2+4文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0158-06

收稿日期：2015-01-19

基金項目：校企合作項目橫向課題（編號：0257-5001601）。

作者簡介：崔鄭龍（1989—），男，碩士研究生，主要從事微生物資源研究。E-mail：1449006648@qq.com。

通信作者：王愛英，碩士，副研究員，主要從事植物基因工程與安全性評價、微生物資源篩選研究。E-mail：way-sh@126.com。棉花枯萎病是棉花的主要病害之一，其病原菌為尖孢鐮刀菌萎蔫專化型（Fusarium oxysporium f.sp.vasinfectum）。這種真菌在自然條件下很容易存活，主要通過土壤、種子、肥料進行傳播[1]。長期使用化學藥劑控制土傳性病害會提高種植成本，加重環境污染。輪作、曬土、深耕等方法雖能減少污染，但很難滿足日益增長的生產需求[2]。通過生物防治方法來控制棉花枯萎病，具有可持續性強、減少環境污染等優點，發展前景廣闊。植物內生細菌和維管束中導致植物萎蔫的病原菌有相似的生態位，是生物防治的潛在資源。目前，研究人員已經從甘草[3]、大蒜[4]、香蕉[5]、棉花[6]、茶樹[7]等上百種植物中分離出具有抑制病原真菌作用的內生菌，但對于拮抗菌抑菌機理的研究仍然處于初步階段。研究表明，植物內生菌主要通過生態位和營養的競爭、分泌抑菌物質、誘導寄主抗性來抑制植物病原菌生長。有些內生細菌產生的植物激素、磷酸鹽、黃酮類物質、抗生素復合物、揮發性有機物可抑制病原菌定植，這也是細菌在植物體內競爭生存空間的一種有效機制[8-10]。植物產生化合物的不同將影響植物內生菌群落的差異，植物的防衛反應對其內生菌種群變化具有一定影響，是抵御相關真菌入侵的重要途徑之一[11]。優勢菌株繁殖將通過激活植物防御反應，從而影響其他微生物的種群變化。烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）和苦豆子（Sophora alopecuroides Linn.）都屬于多年生豆科草本植物，阿魏（Ferula asafoetida）屬于多年生傘形科草本植物。龔明福等和畢江濤等已經分別從苦豆子、甘草中分離出了抑制枯萎病菌的內生菌，但研究較為初步[12-13]。本研究中的甘草、阿魏、苦豆子采集于新疆維吾爾自治區石河子市。該地區屬于半干旱地區，土壤鹽堿化較為嚴重，從中篩選出抑制枯萎病菌的內生菌，選擇抑制效果最好的拮抗菌A，分別檢測胞外、胞內分泌物的抑菌效果及其對棉花種子萌發的影響，并測定處理后棉花葉片中多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的變化情況，旨在為闡明棉花枯萎病菌抗內生菌的抑菌機制和分離抑菌物質提供依據。

1材料與方法

1.1供試材料及培養基

采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基（NA）分離純化植物內生細菌，采用LB培養基富集拮抗菌，采用查式一號培養基富集培養病原真菌，采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）作為拮抗性試驗培養基。供試材料：烏拉爾甘草、阿魏、苦豆子采集于石河子大學北區試驗田，棉花品種為新陸早7號，棉花枯萎病病原菌、棉花種子由石河子大學生命科學學院農業生物技術重點實驗室提供。

1.2植物內生菌的分離

分別選取甘草、阿魏、苦豆子主莖基部向上10～15 cm的莖段、向下10～15 cm的根段以及健康飽滿的葉片，分別用75%乙醇浸泡30 s，1%HgCl2浸泡3 min，無菌水沖洗4～5遍，用無菌濾紙吸干水分。將根和莖切成5 mm長小段，葉片剪成條狀，分別接種在NA平板中，每板5個，28 ℃培養2～3 d。將生長出的細菌進行純化培養，保存待用。

1.3棉花枯萎病拮抗菌的篩選

初篩：將棉花枯萎病病原菌在查氏一號液體培養基中活化培養3 d，沾取菌體懸浮液接種在PDA平板中央，28 ℃培養3 d。挑取分離到的甘草內生菌接種在枯萎病菌菌落的四周，每個平板接種4個點，28 ℃培養3～5 d，選取周圍有明顯抑菌圈的細菌進行復篩。光學顯微鏡下觀察枯萎病菌形態結構變化。復篩：將培養3 d的枯萎病菌培養液用4層紗布過濾，用顯微計數法測定其孢子濃度。在PDA平板中加入200 μL 枯萎病菌的孢子懸液，涂布均勻。平板中間打直徑5 mm 的孔并封住孔底。將初篩的生防菌在NA液體培養基中28 ℃培養48 h，取40 μL生防菌發酵液置于孔內（無菌水為對照）。每處理重復 3次，4 ℃存放16 h，28 ℃培養3～5 d后測量抑菌圈大小。

1.44種拮抗菌的鑒定

1.4.1生理生化檢測4種拮抗菌的生長曲線、最適pH值、糖發酵、淀粉水解試驗、革蘭氏染色試驗[14]。

1.4.2拮抗菌的16S rDNA鑒定采用CTAB法[15]提取拮抗菌 DNA，采用細菌16S rDNA的通用引物擴增引物，F5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，R5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應體系：DNA模板3 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPmix 2 μL，相應的引物10 μmol/L各1 μL，TaqDNA聚合酶5 U/μL 0.5 μL，ddH2O 16 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸7 min，4 ℃保溫24 h。PCR產物經1%的瓊脂塘凝膠電泳分析，委托華大基因公司進行測序。序列GenBank數據庫分析比對，運用ClustalX 2.0、MEGA 5.10軟件建立系統發育樹。

1.5拮抗菌A胞外、胞內分泌物對枯萎病菌的影響

1.5.1拮抗菌A胞外、胞內分泌物的制備選擇拮抗效果最好的拮抗菌A置于LB培養基中，28 ℃ 200 r/min 分別培養6、9、12、15、18 h，測量菌液在600 nm處的吸光度，確定其濃度。取40 mL菌液于50 mL試管中，6 000 r/min 離心10 min。上清液過濾除菌（0.22 μm），得到含有胞外分泌物的溶液。沉淀中加入10 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH值7.2），充分混勻，冰浴超聲波破碎細胞，得到含有胞內分泌物的溶液。將含有胞外、胞內分泌物的溶液涂布于LB平板上，確定無活菌體存在。

1.5.2胞外、胞內分泌物對枯萎病菌菌絲生長的影響將含有胞外、胞內分泌物的溶液分別稀釋1、10、100倍，各取100 μL稀釋液與融化的PDA培養基混勻于平板中。完全凝固后，用0.5 cm的打孔器取枯萎病菌菌餅放于平板正中央。每個菌株胞內外分泌物重復3次，以加入無菌水為對照，28 ℃培養4 d，測量枯萎病菌菌落的直徑，計算抑制率。

1.5.3胞外、胞內分泌物對枯萎病菌產孢的影響將枯萎病菌菌絲塊接種于PDA培養基中央，28 ℃培養至菌落直徑達4.5 cm，挖除周圍培養基，分別取上述胞外、胞內分泌物稀釋液20 mL倒入平板處理20 min（無菌水為對照），傾去溶液，28 ℃繼續培養3～5 d至孢子產生，每平板用10 mL無菌水將孢子洗下，4層紗布過濾得孢子懸浮液，顯微觀察記錄孢子數，并計算產孢抑制率。

1.5.4胞外分泌物與胞內分泌物對枯萎病菌孢子萌發的影響取50 μL上述胞外、胞內分泌物稀釋液置于凹玻片凹槽中（無菌水作為對照），加入50 μL枯萎病菌孢子懸浮液，混合后用蓋玻片蓋嚴，28 ℃恒溫培養。分別在0、4、8、12、16、20、24、28 h鏡檢孢子萌發情況，測量孢子的長度。每樣品重復 4 次，每次重復檢查5個視野，記錄數據并計算孢子萌發的平均長度。

1.6拮抗菌A對棉花的影響

1.6.1拮抗菌A對棉花種子萌發的影響采用70%乙醇清洗棉花種子30 s，無菌水沖洗3～4次，每次5 min，分裝于平板中，每個平板30粒種子。取20 mL拮抗菌A培養液浸泡種子10 min（無菌水作對照），傾去培養液，無菌水清洗3次，每次20 mL。25 ℃恒溫保濕培養，3 d后調查種子萌發率。

1.6.2棉花活性氧酶系統分析按照草炭土、珍珠巖、蛭石為2 ∶1 ∶1的比例配制土壤，將棉花枯萎病菌孢子懸液（30 mL/盆）混合在土壤中（蒸餾水作對照）。將棉花種子用70%乙醇表面消毒30 s，用蒸餾水沖洗3～4次，每次5 min，用拮抗菌A培養液浸泡種子10 min（無菌水作對照），傾去培養液，清洗3次，室溫（23 ℃）浸泡24 h，播種在直徑為20 cm的營養缽中，每缽播種10粒，常規管理。播種后第20天計算成活率，之后每盆補加拮抗菌A培養液10 mL于土壤中，菌液濃度為 106 CFU/mL，以蒸餾水作為對照。播種后第40天、第50天、第60天、第70天分別測定POD、PPO、PAL活性[16]。

2結果與分析

2.1棉花枯萎病拮抗菌的分離和篩選

分離得到來自甘草、阿魏、苦豆子不同植株部位的內生細菌共計25株，其中有11株來自甘草，5株來自阿魏，9株來自苦豆子。篩選得到7株對枯萎病菌有抑制作用的內生菌，選擇了4株抑菌效果較好的菌株進行復篩（表1）。顯微觀察抑菌圈附近的菌絲形態，發現有明顯的變形（圖1）。菌株A初篩的抑菌效果最佳，抑菌圈直徑為26.96 mm，與其他菌株差異顯著。菌株B在復篩中表現出較大的抑菌圈，但和A菌株抑菌圈直徑無顯著差異。

2.24株拮抗菌的生長特性

A、B、C、D的生理生化檢測結果表明，4株拮抗菌的最適pH值都偏酸性，A、B、C為革蘭氏陽性菌，D為陰性菌（表2）。

2.3拮抗菌的16S rDNA鑒定

菌株A、B、C、D的16S rDNA序列通過鄰位相接法建立的系統發育樹（圖2）。A與Bacillus amyloliquefaciens較相似，遺傳距離為1.972。B與Bacillus tequilensis較相似，遺傳距離為0.009。C與Bacillus sp. 較相似，遺傳距離為1.970。D與

2.4拮抗菌A胞外、胞內分泌物對枯萎病菌的影響

2.4.1胞外、胞內分泌物對枯萎病菌菌絲生長的影響拮抗菌A胞外、胞內分泌物對枯萎病菌菌絲生長的平均抑制率分別為8.55%、9.41%（圖3-a）。抑制率隨著菌液濃度的增加而增加，富集18 h的胞外分泌物對菌絲生長的抑制率達27.60%；富集15 h的胞內分泌物抑制率達32.93%（圖3-a、圖3-b）。胞外、胞內分泌物的最大抑制率均出現在細菌生長的穩定期。

2.4.2胞外、胞內分泌物對枯萎病菌產孢的影響拮抗菌A胞外、胞內分泌物對枯萎病菌產孢的平均抑制率分別為26.32%、40.14%（圖4）。胞外分泌物的抑制率在對數期中后期有一定下降，在穩定期達最大值，富集18 h的胞外分泌物抑制率達72.29%；胞內分泌物的抑制率在對數期早期顯著增加并達到最大值，對數期中后期逐漸穩定，穩定期有所回落，富集9、15 h的胞內分泌物抑制率達88.81%。

2.4.3胞外、胞內分泌物對枯萎病菌孢子萌發的影響孢子萌發長度隨培養時間的增加而增加（圖5-a），富集9 h的胞外分泌物在孢子萌發24 h時抑制率最大，達到23.15%；富集15 h的胞內分泌物在孢子萌發28 h時抑制率最大，達到26.09%。顯微觀察發現，胞外、胞內分泌物處理枯萎病菌后，部分孢子在萌發時，出現了菌絲畸形、斷裂的現象，其中胞內分泌物處理后變化比較明顯（圖5-b）。

2.5拮抗菌A對棉花生長的影響

2.5.1拮抗菌A對棉花種子萌發的影響拮抗菌A處理對棉花種子濕質量、干質量、發芽率并無顯著影響，但對其成活率具有顯著影響（表3）。單獨用拮抗菌A處理過的種子成活率增至48.33%，單獨用枯萎病菌處理的種子成活率下降至

35.83%，均與對照差異顯著。拮抗菌A與枯萎病菌共同作用時，棉苗的成活率與對照一致。

2.5.2棉花POD、PPO、PAL分析棉花播種40 d，共同用拮抗菌A和枯萎病菌處理組的PAL活性顯著提高，單獨用A或枯萎病菌處理的棉花PAL活性也與對照差異顯著。其他處理下PAL、POD 、PPO活與對照差異不顯著（表4）。

3結論與討論

目前應用較多的生防細菌主要有芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞桿菌屬（Pseudomonas）、土壤放射桿菌（Agrobacterium radiobacter）等。其中芽孢桿菌屬具有抗逆性強、抗菌譜廣等特點，是植物微生態體系中的優勢微生物種群，是理想的植物病害生防細菌來源之一[17]。本研究得到的抑菌效果最好的拮抗菌A為解淀粉枯草芽孢桿菌，分離自甘草的葉片，它增

殖速度快，富集12 h菌濃度可達108 CFU/mL，枯萎病菌達到這一濃度需要在相同條件下富集72 h，這使得拮抗菌A能夠在植物中占據優勢地位。

枯草芽孢桿菌的生防作用機制多樣，主要有競爭、拮抗、溶菌、誘導植物抗病性和促進植物生長等[18]。已經有學者從拮抗內生菌發酵液中分離出了抑制枯萎病菌的物質，這些抑菌物質主要包括化合物[19]、脂肽[2]、糖類[20]、蛋白[21]，這些物質的分泌對于拮抗菌在植物中占據有利地位起到了關鍵作用。枯草芽孢桿菌分泌產生的抑菌蛋白對植物病原菌抑制作用機制包括抑制病原菌孢子產生、萌發，導致菌絲畸形，細胞壁溶解和原生質泄露。本研究從抑制枯萎病菌菌絲生長、產孢、孢子萌發3個方面檢測胞外、胞內分泌物的抑菌活性，發現其抑制產孢的作用較為明顯。雖然通過顯微觀察發現胞內、胞外分泌物也能引起菌絲畸形、孢子萌發遲緩，但抑制率

遠遠低于對產孢的抑制率，因此抑制產孢可能是胞內、胞外分泌物的主要抑制途徑。此外，同種細菌在不同的生長時期，其胞內各種酶的活性、營養需求及代謝產物均有一定差異。細菌在接近穩定期時，次生代謝產物開始積累[22]。本研究的最佳抑制率出現在對數期，且胞內分泌物在抑制菌絲生長、產孢、孢子萌發3個方面均高于胞外分泌物，可能意味著這種抑菌物質并非拮抗菌A的最終代謝產物。對數期抑菌物質的合成有助于細菌提前占據優勢，抑制枯萎病菌的發展。

植物抗病性反應可以通過植物體內活性氧酶的活性變化來反映，這些酶包括PPO、POD、PAL、超氧化物歧化酶（SOD）、β-1，3-葡聚糖酶等[23]。很多拮抗菌通過激活植物防御反應，從而在植物中占領生存空間，這種機制提高了植物對于病原菌的抵御能力。枯草芽孢桿菌TR21可誘導香蕉防御反應，枯草芽孢桿菌B29、解淀粉芽孢桿菌K103均可誘導黃瓜防御反應[24-26]。并非所有拮抗菌都能引起植物的防御反應。本研究測定了POD、PPO、PAL 3種酶在拮抗菌A處理棉花種子后的酶活變化情況，發現棉花播種40 d，共同用拮抗菌A和枯萎病菌處理組的PAL活性顯著提高，單獨用拮抗菌A或枯萎病菌處理的棉花PAL活性也與對照差異顯著，其他處理下PAL、POD 、PPO活性與對照差異不顯著。可以推測拮抗菌A并沒有引起棉花的系統誘導抗性，可見引起植物系統誘導抗性并不是拮抗菌A的主要抑制途徑。

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