骨髓間充質干細胞與納米羥基磷灰石復合骨修復材料的研究進展*

王會丹，葉利遠，井申榮，孟增東

（1.昆明理工大學醫學院，昆明650500；2.昆明理工大學附屬昆華醫院骨科，昆明650032；3.云南省第一人民醫院骨科，昆明650032）

1 引 言

骨髓間充質干細胞（BMSCs）是骨髓中一類具有多分化潛能、自我復制和高度增殖的干細胞，誘導后分化為成骨細胞、骨細胞、軟骨細胞等多種組織細胞[1]，可作為骨組織工程的理想種子細胞。與一般羥基磷灰石（HA）相比，納米羥基磷灰石（nHA）具有更好的生物活性和生物相容性，能夠更好的與BMSCs復合并促進BMSCs的增殖和分化。然而，目前針對BMSCs與nHA的很多研究只是在體外和動物體內進行，并沒有臨床上的實際應用。本研究通過對體外和動物體內研究進行綜述，找出二者復合的影響因素，為BMSCs與nHA復合骨修復材料臨床應用的可行性提供依據。

2 骨髓間充質干細胞（BMSCs）

BMSCs廣泛分布于骨髓組織、肌肉組織、骨骼組織等多種組織以及臍帶血內，具有自我復制和多向分化的潛能。備受很多研究者關注，并在臨床研究中得到廣泛應用，尤其是骨組織工程。

根據各個階段細胞表面抗原不同，BMSCs演變為成骨細胞過程可分為5個階段：骨祖細胞、前成骨細胞、過度型成骨細胞、分泌型成骨細胞、骨細胞型成骨細胞、骨細胞，這五個階段為研究BMSCs的成骨分化奠定了理論基礎。因膠原蛋白I型（collagen I）本身在未分化的BMSCs中少量表達，待 BMSCs分化后collagen I的表達量升高，而骨鈣蛋白（osteocalcin）、骨橋蛋白（osteopontin）和堿性磷酸酶（ALP）以及鈣結節只在分化BMSCs中表達、形成。所以，collagen I、osteocalcin、osteopontin表達水平和 ALP的活性可作為檢測BMSCs分化、礦化的重要檢測指標[2-4]。

3 納米羥基磷灰石（nHA）

骨組織工程的發展為骨缺損修復帶來希望，且大量研究已證實，骨組織工程方法構建的組織工程骨應用于骨缺損修復的可行性[5]，其主要成分是納米羥基磷灰石。

羥基磷灰石 （HA，Ca10（PO4）6（OH）2）是天然骨的主要成分，具有很好的生物相容性、生物活性和骨傳導性[6-7]，是一種很有希望的生物材料。但因純HA支架材料生物力學性能欠佳，脆性大，且粉末能從骨植入部位發生轉移，導致異位骨的形成，所以限制了它在骨組織工程中的應用[8-9]。

天然骨組織中的HA是以十幾納米的晶體狀態存在，排列有序，為骨組織提供良好的力學性能[10]。與普通HA相比，nHA復合材料成分與天然骨組織成分更相近，且一些力學性能也得到改善，例如彈性、模量、強度、剛度等[11]。與微米級 HA相比，納米級HA表面聚集更多原子，增強了nHA的活性，便于與骨組織結合[12]。同時在納米復合材料中，由于有機物和無機物的聚合，表現出二者所沒有的特性[13]，因此，很多能與nHA聚合并促進其降解的無毒有機聚合物被研發出來，例如脫乙酰殼聚糖（CS，（C6H11O4N）n）[14]等。總之，nHA除具有生物可降解性和無毒性之外，還表現出其他相關良好的特性，包括較好的生物相容性、更好的抗菌活性和最小的異物反應性[15-16]。

4 骨髓間充質干細胞與納米羥基磷灰石的復合

4.1 BMSCs與nHA體外復合和動物體內研究的主要步驟

利用密度梯度離心法，體外獲取BMSCs進行原代和傳代培養。取其第三或四代細胞與不同濃度nHA顆粒材料在恒溫箱中共培養，培養一段時間后，添加誘導液[17]，誘導后將BMSCs與nHA復合效果最好的支架材料植入骨缺損動物體內，觀察它與天然骨的愈合和體內降解情況[18]。植入不同時間后，分別將動物處死，取出植入部位的組織，經免疫組織分析，確定支架體內降解情況和植入體內的可行性。

4.2 BMSCs與nHA體外復合和動物體內研究的檢測技術和指標

針對BMSCs與nHA復合在體外和動物水平上的檢測可概括為以下幾方面：首先，在復合后不同時間點，使用倒置顯微鏡和掃描電子顯微鏡（SEM）觀察誘導一段時間后的培養樣品，檢測BMSCs與nHA的復合情況，觀察BMSCs在nHA上的形態學變化。其次，對BMSCs細胞基質中的肌動蛋白染色并用帶有熒光的探針標記，確定BMSCs在nHA顆粒上的粘附性和nHA顆粒對細胞骨架組裝的影響。然后，用MTT法或流式細胞儀檢測細胞數量，確定細胞生長和增殖情況。最后，可用馬松法和鈣鈷法[19]分別對collagen I和堿性磷酸酶（ALP）染色，檢測其表達水平和表達活性，確定細胞是否已分化和nHA顆粒是否對BMSCs的分化有促進作用。

活性氧自由基（ROS）對細胞產生毒副作用，若不被抗氧化劑保護，細胞膜功能將發生紊亂、蛋白質降解、DNA損傷，最終導致細胞死亡。故細胞內ROS的水平能夠反映細胞壞死狀態，可通過熒光探針測定BMSCs內產生的ROS水平，研究nHA對細胞壞死的影響。Caspase是細胞凋亡過程中一種重要的蛋白酶，可通過檢測BMSCs中Caspase-3／7的活性和進行膜聯蛋白碘化丙啶染色（PI），用細胞流式儀確定nHA對BMSCs凋亡的影響。此外，針對細胞的礦化情況，可用銀染法（Von Kossa）或茜素紅染色法[17]對沉積在細胞外基質的鈣結節進行染色檢測。至于從動物體內取出的植入部位組織，切片后分別用蘇木精-伊紅（HE）和馬松染料對骨形成區域、nHA支架區域和膠原區域進行染色，觀察其各自區域的面積百分比，確定支架體內降解情況和植入體內的可行性。

4.3 BMSCs與nHA體外復合和動物體內研究的影響因素

4.3.1 nHA的屬性對BMSCs生長和增殖的影響一般nHA的孔徑大小為100～400μm時更有利于細胞進入生長，孔隙率大于80%時最有利于細胞附著生長[20]。除孔徑和孔隙率的影響之外，nHA表面粗糙程度也可因影響BMSCs基因的表達而影響細胞增殖的速率[21]。當nHA與BMSCs在血清中共培養時，nHA的血清蛋白吸附能力優于微米羥基磷灰石[22]，且吸附的血清蛋白能促進細胞增殖。同樣相比于微米羥基磷灰石的粗糙表面，細胞更容易在nHA的光滑表面貼壁和增殖[23-24]，主要是因其較微米羥基磷灰石具有更好的親水性和更低的負電荷。總之，nHA的屬性對BMSCs的影響因素有nHA孔徑、孔隙率、表面粗糙程度、蛋白吸附能力以及羥基磷灰石顆粒是否為納米級。

4.3.2 nHA濃度對BMSCs形態、骨架組裝、生存力、壞死和凋亡的影響 經BMSCs檢測指標分析，在高濃度nHA顆粒的懸浮液中共培養時，細胞發生聚集、邊緣不規則化、肌動蛋白組裝受到抑制，并且出現一些不能擴張的液泡。然而，在低濃度的nHA懸浮液中，細胞的形態與對照組相似，它們都由成纖維樣變為棱形。由此可知，僅高濃度的nHA對細胞形態、骨架組裝、生存力、粘附性都存在影響。同樣，通過nHA濃度對BMSCs壞死和凋亡的研究，隨著nHA濃度的增加，熒光強度越強，ROS的含量越高，細胞壞死越快，而早期細胞凋亡百分比卻出現下降，晚期的細胞凋亡百分比變化不顯著。這表明nHA顆粒僅對細胞壞死有影響，而不能誘導細胞凋亡。

4.3.3 鈣磷離子對BMSCs礦化和生長的影響 由于細胞不能分泌過多鈣磷離子用于形成磷酸鹽和碳酸鹽，以致細胞不能礦化。當向培養液中加入鈣磷離子時，細胞的礦化程度隨鈣離子濃度的升高而增強，但對磷離子的濃度變化不顯著。然而，升高磷離子濃度和降低鈣磷離子濃度均能限制細胞生長，僅升高鈣離子濃度時對細胞生長無影響。鈣磷離子是細胞礦化的原材料，向培養液中加入鈣磷離子，雖有利于成骨細胞的礦化[25]，但對細胞的生長有一定的影響。

4.3.4 BMSCs對nHA支架降解的影響 對染色區域經電子計算機斷層掃描（CT）觀察，隨著復合時間的延長，骨形成區域面積隨之增加，支架區域面積隨之減少，且支架的降解速率與骨形成的速度成正相關。由此可知，BMSCs可促進支架的降解[18]。同時nHA的孔壁厚度逐漸減小，孔徑逐漸變大，最終孔破裂，nHA支架消失。經研究得出如下兩方面原因：（1）外源植入物導致肌肉損傷后，參與其中炎性反應的酶和細胞產生的氧自由基和超氧陰離子能加速生物材料降解[26]。（2）成骨和血管的協同作用可促進支架降解，它們通過招募本地的巨細胞去侵蝕和吸收支架，同時增加血液供應，清除代謝產物[27]。

然而，目前骨組織工程支架材料體內降解的確切機制尚不清楚，且降解速度比較慢，時間比較長。BMSCs在復合材料上能夠生長、增殖、分化、壞死、凋亡和礦化的確切機制和信號通路也尚不被熟知。由于骨組織工程技術和方法尚未顯現出更大的突破，支架材料的研究仍停留在體外實驗和動物體內實驗，臨床上的研究還不成熟。

5 展望

BMSCs的自我復制和多向分化潛能為二者的復合奠定了基礎，nHA的特性為二者的復合提供了良好條件。collagen I、osteocalcin、osteopontin和堿性磷酸酶（ALP）的表達量以及鈣結節的形成，為BMSCs的成骨分化和礦化提供了檢測指標。nHA的孔徑和孔隙率不僅是良好nHA支架材料的重要評定參數指標，而且nHA合適的濃度、孔徑和孔隙率也為細胞的附著和生長提供了重要的先決條件。與微米級HA相比，nHA不僅具有更好的生物相容性、生物活性和骨傳導性，還能促進BMSCs的增殖。希望在不久的將來，研究者能研制出更好的仿生nHA骨修復材料，廣泛應用于臨床。