番茄ISSR-PCR反應體系的優化與驗證

李永平，康建坂，林　琿（福建省農業科學院蔬菜研究中心，福州500；福建省農業科學院作物研究所，福州500，福建省蔬菜工程技術研究中心，福州500）

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番茄ISSR-PCR反應體系的優化與驗證

李永平1,2,3，康建坂1,2,3，林琿1,2,3
（1福建省農業科學院蔬菜研究中心，福州350013；2福建省農業科學院作物研究所，福州350013，3福建省蔬菜工程技術研究中心，福州350013）

摘要：研究番茄ISSR-PCR反應體系中主要因子TaqDNA聚合酶、dNTP、引物和DNA模板的濃度及各引物的退火溫度對擴增結果的影響，建立番茄ISSR-PCR反應的優化體系，為ISSR技術在番茄分子輔助育種應用提供參考。實驗確定番茄ISSR-PCR 20 μL反應體系為：2.0 μL 10×PCR緩沖液，0.3 μmol/L引物，50 ng模板DNA，0.5 mmol/LdNTP，2 U TaqDNA聚合酶，各引物最佳退火溫度有所不同。

關鍵詞：番茄；親緣關系；ISSR；優化

0　引言

在生物技術研究領域中，分子技術一直是研究的熱點。ISSR結合了SSR和RAPD的優點，克服了RFLP與RAPD的不足，簡單方便，可以檢測到更高的種間遺傳差異，穩定性也較高[1-3]。因此，ISSR標記技術被廣泛應用于遺傳多樣性[4-6]、遺傳圖譜構建[7-8]、種子純度鑒定[9-10]、植物分類學[11]等研究中，但ISSR-PCR的擴增效果受物種、反應體系及擴增程序等的影響，不同作物最佳反應體系差異較大。

番茄(Lycopersicon esculentum)因果實營養豐富，具特殊風味，是在全世界栽培最普遍的果菜之一，中國各地也普遍種植。1994年，加拿大蒙特利大學Zietkiewicze等[12]利用了RAPD技術優點和基因組中豐富的SSR序列信息，提出了一種新的分子標記技術（inter-simple sequence repeat，簡單重復間序列，ISSR）。它可用少量DNA在沒有分子生物學研究基礎的情況下構建基因組指紋圖譜[13-15]，由于可同時檢測多個SSR座位，重復性好，被廣泛應用于遺傳多樣性[16-19]、種質資源鑒定[12]、分子輔助育種[20]、基因定位[21]、種子純度鑒定[22-23]、植物分類學[24]等方面。ISSR標記能補充遺傳圖譜中一些RFLP標記稀少、間斷或空白區，它在QTL定位中也逐漸得到較多的應用[1-2]。ISSR是基于PCR的分子標記技術，不同植物材料、實驗材料及不同擴增條件都將影響其擴增效果[3-4]。

筆者對影響番茄ISSR-PCR反應體系主要因素進行優化實驗，旨在建立番茄ISSR-PCR最佳反應體系，為ISSR技術在番茄分子輔助育種應用提供參考。

1　材料與方法

1.1供試材料

研究所用材料由福建省農業科學院蔬菜中心提供，體系建立材料為番茄高代自交系T9，驗證材料為38個番茄高代自交系。

主要試劑為10×PCR buffer（含Mg+，Tiangen公司產），TaqDNA聚合酶（Tiangen公司），dNTP（上海生工生物工程公司產），Mark2000（上海生工生物工程公司產）。ISSR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2實驗方法

1.2.1基因組DNA的提取與檢測各番茄品種選取3株健壯、無病蟲害、具有本品種特征特性的植株混合取樣，每株摘取1～2片幼小、舒展的心葉，用改進的微量CTAB法[5-8]提取DNA。加入1μLRNase，37℃水浴30min，純化DNA。檢測各樣品的純度并計算其濃度，將各樣品濃度稀釋至50 ng/μL備用。用8 g/L瓊脂糖凝膠電泳，檢測DNA的完整性。

1.2.2 ISSR-PCR擴增及產物的電泳分析擴增反應在GeneAmp PCR System 9600（Applera公司）上進行。實驗采用20 μL體系：2.0 mmol/L MgCl2，2.0 μL10× PCR緩沖液，50 ng模板DNA，0.3 μmol/L引物，0.50 mmol/LdNTP，2.0 U TaqDNA聚合酶，加入超純水至20 μL。PCR擴增程序為：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，52.2℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個循環；72℃延伸5 min，4℃保存。PCR擴增產物用15 g/L的瓊脂糖凝膠在120 V穩壓電泳50 min，EB染色15 min，在GDS 8000凝膠成像系統（UVP公司）上觀察并拍照。

1.2.3 ISSR-PCR擴增反應因素篩選及程序調整以番茄高代自交系T9 DNA為模板，ISSR引物823，對ISSR擴增反應其中一成分設置梯度進行篩選時，保持其他成分的濃度不變，用雙蒸水調節保持總體積不變；擴增程序中的退火溫度設計12個溫度梯度49.0、50.0、 51.0、51.5、52.0、52.2、52.5、52.8、53.0、54.0、55.0、56.0℃。

2　結果與分析

2.1 DNA模板濃度對番茄ISSR-PCR的影響

DNA模板是影響PCR擴增重要因素，對模板DNA濃度進行優化非常必要。ISSR-PCR反應中，DNA濃度太低可能無擴增產物，濃度過高則出現非特異性擴增條帶甚至會抑制擴增。反應結果見圖1，模板使用量在30～100 ng范圍內5個不同量的DNA模板均有擴增產物，DNA量在少于50 ng時，隨著DNA量增加條帶逐漸清晰，隨后DNA量增加條帶清晰度下降，當DNA量增加到100 ng時條帶就有缺失，50 ng時條帶最為清晰。

圖1　DNA模板濃度對番茄ISSR-PCR的影響

2.2引物用量對番茄ISSR-PCR的影響

引物濃度影響引物與DNA模板配對概率，從而影響ISSR-PCR擴增效率。引物濃度低，與DNA模板結合位點就少，擴增產量就低；濃度過高，產生非特異性擴增，帶型彌散模糊。引物用量對番茄ISSR擴增的影響結果見圖2。用量為0.1、0.2、0.4、0.5 μmol/L時擴增條帶比較模糊，用量0.3 μmol/L時條帶最清晰，因此，最終選用0.3 μmol/L為最佳用量。

2.3 dNTP濃度對番茄ISSR-PCR的影響

dNTP作為PCR反應原料，濃度直接影響反應產量與特異性。不同濃度的dNTP對番茄ISSR擴增產物的影響結果見圖3。可見實驗體系使用的濃度為0.25～0.625 mmol/L時隨濃度升高，條帶清晰度增加，濃度到0.75 mmol/L時，條帶模糊。濃度為0.5、0.625 mmol/L條帶較為清晰，考慮材料的成本，選擇dNTP濃度為0.5 mmol/L。

2.4 TaqDNA聚合酶濃度對番茄ISSR-PCR的影響

PCR擴增效果直接受到TaqDNA聚合酶活性和用量影響。用量過少，酶過早消耗完，產物就少；用量過多，產生非特異擴增，帶型彌散。5個TaqDNA聚合酶濃度梯度的擴增結果見圖4。濃度為2、2.5 U時條帶完整清晰，3 U時條帶彌散模糊，綜合考慮擴增效果與成本，選用TaqDNA聚合酶濃度為2 U。

圖2　引物用量對番茄ISSR-PCR的影響

圖3　dNTP濃度對番茄ISSR-PCR的影響

圖4　TaqDNA聚合酶濃度對番茄ISSR的影響

2.5退火溫度的篩選

退火溫度對ISSR-PCR反應結果影響很大，實驗設計的12個溫度梯度49.0、50.0、51.0、51.5、52.0、52.2、52.5、52.8、53.0、54.0、55.0、56.0℃篩選引物的最佳退火溫度（表1）。實驗結果表明，每條引物有其獨特的退火溫度，23條引物中退火溫度最低的為49.0℃，最高的是55.0℃。各引物的最佳退火溫度與TM值之差大多在5℃之內，引物874的最佳退火溫度與TM值之差達到9.7℃。

表1　23個差異引物的退火溫度

2.6體系的驗證

引物868對38個番茄高代自交系在50 ng模板DNA，0.3 μmol/L引物，0.50 mmol/L dNTP，2.0 U TaqDNA聚合酶，2.0 mmol/L MgCl2，2.0 μL10 PCR緩沖液，加入滅菌的超純水至20 μL的體系，退火溫度50.0℃進行ISSR-PCR擴增（圖5），表明實驗所建立的番茄ISSR-PCR的反應體系擴增效果良好。

圖5　引物868擴增的ISSR譜帶圖

2.7番茄ISSR-PCR的反應體系的確立

通過實驗確立的番茄ISSR-PCR的20 μL反應體系為：2.0 μL 10×PCR緩沖液，50 ng模板DNA， 0.3 μmol/L引物，0.50 mmol/L dNTP，2.0 U TaqDNA聚合酶，加入滅菌的超純水至20 μL。擴增程序為94℃預變性5 min；94℃變性1 min，50℃，退火1 min，72℃延伸2 min，35個循環；72℃延伸5 min。各引物退火溫度有所差異參照表1。

3　討論

在生物技術研究領域中，分子技術一直是研究的熱點。ISSR結合了SSR和RAPD的優點，克服了RFLP與RAPD的不足，簡單方便，可以檢測到更高的種間遺傳差異，穩定性也較高[9-11]。但ISSR-PCR的擴增效果受物種、反應體系及擴增程序等的影響，不同作物最佳反應體系差異較大。根據不同物種ISSR-PCR反應最佳體系報道[25-28]，引物用量多在0.1～0.8 μmol/L，模板DNA在30～100 ng，dNTP 0.1～0.4 mmol/L，TaqDNA聚合酶0.5～1.5 U。本實驗TaqDNA聚合酶用量較高,20 μL反應體系中TaqDNA聚合酶濃度為2、2.5 U時條帶完整清晰,dNTP用量也較高，濃度為0.5、0.625 mmol/L條帶較為清晰，模板DNA、引物用量與大部分研究一致。

筆者研究表明，退火溫度是影響實驗結果的關鍵因素，且各引物的最佳退火溫度差異較大，23個引物的最佳退火溫度在49.0～55.0℃。ISSR標記使用單引物，長度15～22 bp，各引物TM值不同。林鄭和等[29]在建立茶樹ISSR-PCR反應體系時發現，退火溫度在大于引物TM值2～3.0℃。何海旺等[30]研究馬鈴薯ISSRPCR反應體系則認為，不同引物對退火溫度的反應規律不同，退火溫度較TM值有高有低，但基本都在5℃以內。筆者的結果與兩者的研究均有不同，退火溫度與TM值之差最大達到9℃以上。這可能研究物種與引物序列有關。

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Optimization and Verification of ISSR-PCR Reaction System for Lycopersicon esculentum

Li Yongping1,2,3,Kang Jianban1,2,3,Lin Hui1,2,3
(1Vegetable Centre,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350013,Fujian,China;2Institute of Crop Sciences,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350013,Fujian,China;3Engineering Research Center for Vegetable in Fujian,Fuzhou 350013,Fujian,China)

Abstract:To study the optimization of ISSR-PCR reaction system for Lycopersicon esculentum,the effects of five main factors(TaqDNA polymerase dosage,dNTP concentration,primer concentration,DNA templates concentration and annealing temperature of each primer)on ISSR amplification were investigated,to lay a foundation for ISSR technique in tomato molecular assisted breeding.The results showed that the optimal ISSR-PCR reaction system(20 μL)contained 50 ng DNA template,0.3 μmol/L primer,0.5 mmol/L dNTP,2 U TaqDNA polymerase,and 2.0 μL 10×PCR buffer.In addition,the optimal annealing temperature of each primer for ISSR-PCR reaction was different.

Key words:Lycopersicon esculentum;Genetic Relationship;Inter-simple Sequence Repeat;Optimization

收稿日期：2015-08-20，修回日期：2015-11-16。

通訊作者：康建坂，男，1976年出生，福建永春人，副研究員，碩士，研究方向：蔬菜育種。

作者簡介：第一李永平，女，1974年出生，福建順昌人，碩士，研究方向：蔬菜育種。

通信地址：350003福建省福州市五四路247號福建省農科院高新大樓1711，E-mail：248937256@qq.com。 350003福建省福州市五四路247號福建省農科院高新大樓1711，E-mail：68787369@qq.com。

基金項目：福建省自然科學基金項目“利用SSR和SRAP標記構建辣椒遺傳圖譜”(2014J01115)；福建省農業科技重大專項“茄果類蔬菜新品種選育與種業產業化研究”(2013NZ0002-3)。

中圖分類號：S795.9

文獻標志碼：A論文編號：cjas15080012