蘆筍種質(zhì)資源的SRAP遺傳多樣性分析

李　霞，李書(shū)華，楊　林，于繼慶，李保華，鄭　鑫，包艷存（山東省濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東濰坊261071）

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蘆筍種質(zhì)資源的SRAP遺傳多樣性分析

李霞，李書(shū)華，楊林，于繼慶，李保華，鄭鑫，包艷存
（山東省濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東濰坊261071）

摘要：為了更深入地揭示蘆筍品種（系）的遺傳多樣性，本研究采用SRAP技術(shù)對(duì)國(guó)內(nèi)外12個(gè)蘆筍栽培種和雜交種的遺傳多態(tài)性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，從170對(duì)引物中篩選出29對(duì)多態(tài)性強(qiáng)、條帶清晰的引物，每對(duì)引物產(chǎn)生12～36條譜帶，共產(chǎn)生551條譜帶，其中多態(tài)性條帶343條，占總帶數(shù)的61.21%。平均每個(gè)引物擴(kuò)增的DNA帶數(shù)是20.41條，多態(tài)性帶數(shù)是12.7條。采用NTSYSpc2.1軟件對(duì)SRAP擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行聚類分析，12份蘆筍材料的相似系數(shù)在0.39～0.97之間，平均相似系數(shù)為0.69。在Coefficient=0.69處劃等值線，可將12份蘆筍材料劃分為4類。第一類：‘魯蘆筍一號(hào)’、‘88-5’、‘格蘭德’、‘07-1’和‘06-6’。第二類：‘阿波羅’、‘澤西巨人’和‘阿特拉斯’。第三類：‘西班牙達(dá)瑪斯’。第四類：‘荷蘭全雄’、‘UC800’和‘西德全雄’。

關(guān)鍵詞：蘆筍；種質(zhì)資源；SRAP；遺傳多樣性

0　引言

相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)是一種新型的基于PCR的標(biāo)記系統(tǒng)，由美國(guó)加州大學(xué)蔬菜作物系Li與Quiros博士于2001年提出[1]。該技術(shù)與其他分子標(biāo)記技術(shù)相比有明顯的優(yōu)越性，如實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、多態(tài)性高、在基因組中分布均勻、實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定、引物具有通用性等。近年來(lái)SRAP技術(shù)已被用于黃花蒿[2]、麻櫟[3]、甜瓜[4]、蔥[5]、桂花[6]等作物的遺傳多樣性分析和親緣關(guān)系鑒定等方面。蘆筍(Asparagus officinalis L.)，又稱石刁柏，是百合科天門冬屬植物，該屬約有300種，除美洲外，全世界都有分布。核型分析表明該屬植物有二倍體、四倍體和六倍體，共同的染色體基數(shù)x＝10。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)蘆筍的研究多集中在同工酶[7-8]、繁殖栽培技術(shù)[9-10]、細(xì)胞學(xué)等方面的研究[11-12]，而關(guān)于分子水平的研究較少，李媛媛[13]對(duì)蘆筍性別連鎖分子標(biāo)記及蘆筍性別決定基因克隆的研究概況作了綜述。周勁松等[14]2007年，研究表明STS標(biāo)記Asp1-T7在雄性DNA池與雌性DNA池間具有多態(tài)性，可以用來(lái)對(duì)蘆筍雄性兩性株S1群體進(jìn)行性別輔助選擇。周勁松等[15]2012年研究表明顯性標(biāo)記Asp-T7和Asp1-T7sp特異性好，擴(kuò)增效果穩(wěn)定，均能夠鑒別蘆筍雌、雄性別；一共測(cè)驗(yàn)了14株蘆筍兩性株自交后代S1代的雄株，從中篩選出2株超雄株。高武軍[16]利用RAPD技術(shù)對(duì)石刁柏雌雄株基因組差異進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了2條雌性相關(guān)的RAPD片斷，長(zhǎng)度分別為928、1178 bp。蘇俊祥[17]利用RACE技術(shù)從石刁柏中分離了一個(gè)SUPERMAN類單鋅指蛋白的基因AoSUP，并對(duì)AoSUP的基因序列、蛋白結(jié)構(gòu)、雌雄株不同營(yíng)養(yǎng)組織表達(dá)差異進(jìn)行了初步分析。李霞等[18]以蘆筍(Asparagus officinalis L.)為材料，對(duì)影響SRAP-PCR擴(kuò)增結(jié)果的因素dNTPs、Taq DNA酶、Mg2+、引物、模板DNA進(jìn)行了正交優(yōu)化設(shè)計(jì)，確立了適合蘆筍SRAP-PCR分析的最佳反應(yīng)體系。尋找蘆筍種質(zhì)間遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析中適用的有效分子標(biāo)記技術(shù)，是目前蘆筍品種鑒定、遺傳關(guān)系分析及種質(zhì)資源評(píng)價(jià)工作中急需解決的問(wèn)題。本研究就采用SRAP技術(shù)對(duì)12份蘆筍種質(zhì)資源進(jìn)行多態(tài)性分析，在DNA水平上探索蘆筍種質(zhì)資源的遺傳距離，以便為蘆筍種質(zhì)資源的有效利用在分子水平上提供參考。

1　材料與方法

1.1供試材料

所有的試驗(yàn)材料均來(lái)自于山東省濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地，選取當(dāng)年萌發(fā)的幼嫩筍或葉片，洗凈、吸干水分，于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩９?2份（表1）。

表1　供試12份蘆筍材料

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1基因組DNA提取采用改良的CTAB法[19]提取蘆筍DNA，產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，選出符合試驗(yàn)要求的DNA樣品，-20℃保存。

1.2.2 SRAP-PCR擴(kuò)增擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，35℃復(fù)性1 min，72℃延伸1.5 min，共5個(gè)循環(huán)；30 s后，94℃變性1 min，50℃復(fù)性1 min，72℃延伸1.5 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃保存。1.2.3電泳檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)在美國(guó)ApolloATC-401擴(kuò)增儀上完成。擴(kuò)增產(chǎn)物采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳緩沖液為1×TBE，恒功率70 W，溴酚藍(lán)距離凝膠2～3 cm處結(jié)束電泳。電泳后銀染。蒸餾水沖洗后照相或者保存。

2　結(jié)果與分析

2.1基因組DNA的質(zhì)量檢測(cè)

將提取的12份基因組DNA用TE溶解后，1%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)觀察，照相。結(jié)果顯示，蘆筍基因組DNA帶型表現(xiàn)整齊、清晰（圖1）。

圖1　12份蘆筍基因組DNA電泳結(jié)果

2.2 SRAP-PCR反應(yīng)體系的正交優(yōu)化

蘆筍SRAP-PCR反應(yīng)體系參照李霞[18]的正交優(yōu)化反應(yīng)體系。20 μL的反應(yīng)體積中包括0.2 mmol/LdNTPs 0.4 μL；1 U Taq DNA酶1.0 μL；1.5 mmol/L Mg2+1.2 μL；上下引物各30 ng，每個(gè)引物0.5 μL；60 ng模板DNA1.0μL；10×Buffer2.0μL；無(wú)菌雙蒸水13.4μL。

2.3引物組合篩選

所用引物均購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，上引物17個(gè)，下引物10個(gè)，隨機(jī)排列形成170對(duì)引物（表2）。

本試驗(yàn)用優(yōu)化后的體系對(duì)所有170對(duì)引物組合進(jìn)行擴(kuò)增，所用材料為12份蘆筍材料。結(jié)果顯示，有29對(duì)組合均能擴(kuò)增出多態(tài)性強(qiáng)、清晰度高的條帶帶（圖2）。

2.4蘆筍SRAP標(biāo)記遺傳多樣性分析

本試驗(yàn)用篩選出29對(duì)引物對(duì)12份蘆筍材料進(jìn)行重新擴(kuò)增，結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段大小在100～1500 bp之間，每對(duì)引物組合產(chǎn)生12～36條譜帶，共產(chǎn)生551條譜帶，其中多態(tài)性條帶343條，占總帶數(shù)的61.21%。平均每對(duì)引物擴(kuò)增的DNA帶數(shù)是20.41條，多態(tài)性帶數(shù)是12.7條（表3）。不同的引物組合擴(kuò)增出的總帶數(shù)和多態(tài)性帶數(shù)的差異較大，產(chǎn)生帶數(shù)對(duì)多的引物組合是K1，擴(kuò)增出36條帶；產(chǎn)生帶數(shù)最少的引物組合有2個(gè)，分別是E7、K10，擴(kuò)增出12條帶。產(chǎn)生多態(tài)性最高的引物組合是K1，多態(tài)性百分率為86.11%；多態(tài)性較低的引物組合是C3，多態(tài)性百分率為42.86%。引物組合F6擴(kuò)增的SRAP帶型（圖3）。

表2　SRAP隨機(jī)引物的序列

圖2　引物組合篩選擴(kuò)增圖譜

2.5聚類分析

對(duì)12份蘆筍材料的SRAP擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，每個(gè)材料的擴(kuò)增帶按有或無(wú)記錄，“有”附值為1，“無(wú)”賦值為0，從而得到原始數(shù)據(jù)矩陣。采用NTSYSpc 2.1軟件計(jì)算基因型間的Nei氏遺傳相似系數(shù)（表4）。UPGMA法聚類構(gòu)建樹(shù)狀圖（圖4）。由表4可以看出，12份蘆筍材料的相似系數(shù)在0.39～0.97之間，平均相似系數(shù)為0.69，遺傳多樣性相對(duì)偏低。

由圖4可知，在Coefficient=0.69處劃等值線，可將12份蘆筍材料劃分為4類。第一類：‘魯蘆筍一號(hào)’、‘88-5’、‘格蘭德’、‘07-1’和‘06-6’。第二類：‘阿波羅’、‘澤西巨人’、‘阿特拉斯’。第三類：‘西班牙大瑪斯’。第四類：‘荷蘭全雄’、‘UC800’和‘西德全雄’。

表3　29個(gè)引物組合產(chǎn)生的多態(tài)性條帶數(shù)

圖3　引物組合F6的擴(kuò)增產(chǎn)物

從聚類圖上可以看出，各品種的地理來(lái)源同聚類結(jié)果有一定關(guān)系。如來(lái)源于中國(guó)的‘魯蘆筍一號(hào)’和‘88-5’改良系（濰坊市農(nóng)科院自培品種）、來(lái)自美國(guó)的‘格蘭德’和‘07-1’，相似系數(shù)均高達(dá)0.97；在第一類中‘07-1’和‘06-6’均來(lái)自于美國(guó)，相似系數(shù)為0.94。美國(guó)培育的‘澤西巨人’和‘阿特拉斯’（相似系數(shù)為0.81）聚為一小類后，又和‘阿波羅’聚為一類（相似系數(shù)為0.77）。在相似系數(shù)為0.69水平上‘西班牙大瑪斯’單獨(dú)聚為一類。從圖中還可以看出不同的地理來(lái)源，但同為全雄品種也聚為一類，如‘荷蘭全雄’、‘UC800’和‘西德全雄’聚為一類，相似系數(shù)為0.81～0.90，平均相似系數(shù)為0.85。

3　結(jié)論與討論

SRAP分子標(biāo)記技術(shù)不僅多態(tài)性高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單、在基因組中分布均勻、引物具有通用性，而且其正向引物可以與反向引物兩兩搭配組合，因此用少量的引物可組配得到多個(gè)引物組合，提高了引物的使用效率，降低合成引物成本。因而利用SRAP構(gòu)建品種指紋圖譜是一種經(jīng)濟(jì)實(shí)用的方法。本研究采用SRAP技術(shù)對(duì)國(guó)內(nèi)外12個(gè)蘆筍栽培種和雜交種的遺傳多態(tài)性進(jìn)行分析。從170對(duì)引物中篩選出29對(duì)多態(tài)性強(qiáng)、條帶清晰的引物，每對(duì)引物產(chǎn)生12～36條譜帶，共產(chǎn)生551條譜帶，其中多態(tài)性條帶343條，占總帶數(shù)的61.21%。平均每個(gè)引物擴(kuò)增的DNA帶數(shù)是20.41條，多態(tài)性帶數(shù)是12.7條。采用NTSYSpc2.1軟件對(duì)SRAP擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行聚類分析，12份蘆筍材料的相似系數(shù)在0.39～0.97之間，平均相似系數(shù)為0.69。在Coefficient=0.69處劃等值線，可將12份蘆筍材料劃分為4類。第一類：‘魯蘆筍一號(hào)’、‘88-5’、‘格蘭德’、‘07-1’和‘06-6’。第二類：‘阿波羅’、‘澤西巨人’和‘阿特拉斯’。第三類：‘西班牙達(dá)瑪斯’。第四類：‘荷蘭全雄’、‘UC800’和‘西德全雄’。試驗(yàn)結(jié)果與李可峰[20]的比較吻合，說(shuō)明蘆筍總體上差異不大，特別是遺傳基礎(chǔ)在逐漸變窄，與本研究結(jié)果相同。

為此，中國(guó)蘆筍育種除了作好現(xiàn)有優(yōu)良品種的保藏和選育外，還應(yīng)做好以下4方面工作：（1）繼續(xù)選育自有優(yōu)良品種。目前專門從事蘆筍育種研究的有江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、山東省濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院、北京市農(nóng)林科學(xué)院等，育成的品種有15個(gè)，在此基礎(chǔ)上繼續(xù)進(jìn)行蘆筍自有優(yōu)良品種的選育完全有可能實(shí)現(xiàn)。（2）加大兩性株的應(yīng)用。蘆筍雌雄異株，在自然情況下，蘆筍雄株和雌株的株數(shù)大體各占一半。蘆筍性別是由一對(duì)獨(dú)立基因控制的，蘆筍雄性兩性株的遺傳規(guī)律不同于雌、雄株。它們同株可以自交，其自交后代75%為雄株（1/3為同質(zhì)雄株，2/3為異質(zhì)雄株），25%為雌株。在整個(gè)自交選擇中，可以篩選出超雄株，繼而快速選育出全雄品種，蘆筍產(chǎn)量大幅度提升。（3）優(yōu)良品種與野生近緣種雜交。選育出具有野生近緣種抗病性強(qiáng)、耐貧瘠、抗風(fēng)沙等的品種。（4）加大對(duì)外合作力度，廣泛搜集國(guó)外具有優(yōu)良性狀的品種，拓寬親本選擇范圍，徹底改變中國(guó)蘆筍育成品種遺傳基礎(chǔ)狹窄的局面。

表4　12份蘆筍品種的Nei氏相似系數(shù)矩陣

圖4　基于SRAP標(biāo)記的12份蘆筍材料聚類圖

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Genetic Diversity Analysis of Asparagus Based on SRAP Markers

Li Xia,Li Shuhua,Yang Lin,Yu Jiqing,Li Baohua,Zheng Xin,Bao Yancun
(Weifang Academy of Agricultural Sciences,Weifang 261071,Shandong,China)

Abstract:This paper analyzed the genetic polymorphism of 12 asparagus cultivars and hybrids from home and abroad using SRAP method,so as to deeply reveal the genetic diversity of asparagus varieties.The results showed that 29 primers with high polymorphism and clear bands were screened from 170 primers,each of them amplified 12 to 36 bands and a total of 551 DNA fragments were obtained,343 bands showed polymorphism in all fragments,accounted for 61.21%.The average number of DNA bands produced by each primer was 20.41 and polymorphic bands were 12.7.The result of genetic similarity analysis of 12 asparagus genotypes showed that the Nei’s coefficient ranged from 0.39 to 0.97,and the average Nei’s coefficient was 0.69.A DNA molecular dendrogram was established for 12 genotypes which were divided into 4 groups according to the coefficient of 0.69.The first group included‘Lu Asparagus No.1’,‘88-5’,‘Gland’,‘07-1’and‘06-6’. The second group included‘Apollo’,‘Jersey Giant’and‘Atlas’.The third group included‘Spanish Damas’. The forth group included‘Holland all male’and‘West Germany all male’.

Key words:Asparagus officinalis L.;Germplasm;SRAP;Genetic Diversity

收稿日期：2015-10-15，修回日期：2015-12-16。

通訊作者：楊林，男，1980年出生，山東煙臺(tái)人，農(nóng)藝師，推廣碩士，主要從事蘆筍栽培研究。

作者簡(jiǎn)介：第一李霞，女，1976年出生，山東萊蕪人，副研究員，碩士，主要從事蘆筍遺傳育種的研究。

通信地址：261071山東省濰坊市勝利東街1921號(hào)山東省濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，Tel：0536-2118589，E-mail：55654687@qq.com。 261071山東省濰坊市勝利東街1921號(hào)山東省濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，Tel：0536-2118589，E-mail：80408239@qq.com。

基金項(xiàng)目：山東省科技發(fā)展計(jì)劃專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目“蘆筍超雄株技術(shù)研究與示范”(2012GZX21024)。

中圖分類號(hào)：S644.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A論文編號(hào)：cjas15100011