五味子多糖對人膠質瘤U251細胞增殖的影響

呂連杰　亢建民(天津醫科大學研究生院，天津　300070)

?

五味子多糖對人膠質瘤U251細胞增殖的影響

呂連杰亢建民1(天津醫科大學研究生院，天津300070)

〔摘要〕目的探討五味子多糖對人膠質瘤U251細胞增殖的影響。方法人膠質母細胞瘤株U251置于胎牛血清中培養，分為觀察組和對照組。觀察組應用五味子多糖作用于人膠質瘤U251細胞，對照組未應用任何藥物作用于人膠質瘤U251細胞。四甲基偶氮唑藍比色( MTT)法觀察800 μg/ml五味子多糖對人膠質瘤U251細胞增殖的影響。RT－PCR觀察800 μg/ml五味子多糖對人膠質瘤U251細胞周期素( cyclin) B1 mRNA、原癌基因( c－Myc) mRNA的影響。Western印跡觀察800 μg/ml五味子多糖對人膠質瘤U251細胞cyclin B1、c－Myc蛋白的影響。結果培養48 h后，觀察組不同濃度用藥組OD570值均低于對照組，且隨著用藥濃度的上升，五味子多糖對人膠質瘤U251細胞的增殖抑制作用逐漸加強趨勢。觀察組cyclin B1 mRNA、c－Myc mRNA相對表達量均低于對照組( P＜0．05)。觀察組cyclin B1、c－Myc蛋白表達量均低于對照組( P＜0．05)。結論五味子多糖能夠有效抑制人膠質瘤U251細胞增殖，這可能與五味子多糖抑制cyclin B1與c－Myc的表達作用有關。

〔關鍵詞〕人膠質瘤U251細胞;五味子多糖;細胞增殖; cyclin B1; c－Myc

1天津市環湖醫院神經外科

第一作者:呂連杰( 1976－)，男，主治醫師，主要從事神經系統腫瘤的治療。

神經系統腫瘤在臨床上并不常見，但是神經系統腫瘤患者的死亡率十分高〔1〕。膠質細胞瘤屬于神經系統惡性腫瘤之一，往往需要至腫瘤的中晚期方可被確診，目前臨床上外科手術無法有效抑制腫瘤細胞的增殖，部分患者術后生存期甚至不足1年〔2〕。因此，在膠質細胞瘤的治療過程中應用有效的藥物抑制腫瘤細胞的增殖十分關鍵。五味子多糖從五味子干燥成熟果實中提取而來〔3〕，對肝癌〔4〕、乳腺癌〔5〕、甲狀腺癌〔6〕等腫瘤具有十分強的抗癌活性。本文主要探討五味子多糖對人膠質瘤U251細胞增殖及細胞周期的影響。

1資料與方法

1. 1主要試劑五味子多糖由陜西慈緣生物技術有限公司提供，人膠質瘤U251細胞購自上海樊克生物科技有限公司。

1. 2細胞培養及分組將人膠質瘤U251細胞置于胎牛血清( BSA)的RPMI－1640培養液中，在37℃濃度為5%的CO2環境中培養，密切觀察U251細胞的生長情況。在細胞生長密度＞90%后展開U251細胞傳代培養，選擇對數生長期細胞展開實驗。觀察組:應用五味子多糖作用于人膠質瘤U251細胞，藥物濃度分別分成200 μg/ml、400 μg/ml、800 μg/ml。對照組:未應用任何藥物干預人膠質瘤U251細胞。

1. 3四甲基偶氮唑藍比色法( MTT)檢測細胞增殖情況MTT法觀察800 μg/ml五味子多糖對人膠質瘤U251細胞增殖的影響。酶聯免疫檢測儀在570 nm波長處測量吸光度( OD570)值。細胞增殖抑制率=( 1－觀察組OD570水平/對照組OD570水平)×100%。

1. 4 RT－PCR觀察組:應用800 μg/ml五味子多糖作用于人膠質瘤U251細胞。對照組:未應用任何藥物干預人膠質瘤U251細胞。RT－PCR觀察800 μg/ml五味子多糖對人膠質瘤U251細胞細胞周期素B1( cyclin B1) mRNA、原癌基因( c－Myc) mRNA的影響。獲取細胞總RNA，經3次離心操作后棄上清液，干燥30 min，置于焦碳酸乙二酯( DEPC)水溶液中，分別檢測其濃度和質量。選擇反轉錄酶進行反應，總RNA離心后置于冰上，將反應體系在42℃下溫育1 h，95℃下加熱樣品5 min后置于5℃環境下，然后用TE緩沖液將第一鏈cDNA合成反應的體積稀釋到100 μl，－20℃保存待檢。不同基因的特異引物見表1。RT－PCR反應條件95℃，30 s; 40個循環( 95℃，5 s; 60℃，30 s)，導出數據統計分析。

表1不同基因的特異引物

1. 5 Western印跡觀察組:應用800 μg/ml五味子多糖作用于人膠質瘤U251細胞。對照組:未應用任何藥物干預人膠質瘤U251細胞。Western印跡觀察800 μg/ml五味子多糖對人膠質瘤U251細胞cyclin B1、c－Myc蛋白的影響。收集人膠質瘤U251細胞，提取細胞總蛋白。二喹啉甲酸( BCA)法進行蛋白含量測定，然后進行十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠( SDSPAGE)膠電泳。把電泳后獲取的蛋白轉到聚偏二氟乙烯膜，置于50 g/L BSA的Tris鹽酸緩沖液( TBST)中封閉4 h，一抗4℃孵育過夜，選用TBST徹底清洗，加羊抗兔Ⅱ抗并孵育1 h，再次使用TBST徹底清洗，最后通過化學增強發光法( ECL)測定蛋白的表達。所用內參照均使用β－actin。圖像分析軟件AlphaImager 2200測定印跡區帶的光密度。

1. 6統計學方法采用SPSS13．0統計學分析軟件對數據的組間比較進行t檢驗、χ2檢驗。

2結果

2. 1五味子多糖對U251細胞的增殖抑制培養48 h后，觀察組不同濃度用藥組OD570值均低于對照組，且隨著用藥濃度的上升，五味子多糖對人膠質瘤U251細胞的增殖抑制作用逐漸加強趨勢。見表2。

表2五味子多糖對U251細胞的增殖抑制作用

2. 2五味子多糖對U251細胞cyclin B1 mRNA、c－Myc mRNA的影響觀察組cyclin B1 mRNA、c－Myc mRNA相對表達量均低于對照組( P＜0．05)。

2. 3五味子多糖對U251細胞cyclin B1、c－Myc蛋白的影響

觀察組cyclin B1、c－Myc蛋白表達量均低于對照組。見圖1。

圖1五味子多糖對U251細胞cyclin B1、c-Myc蛋白的影響

3討論

腫瘤屬于多基因疾病，不論是抑癌基因的失活還是癌基因的激活，都會引起腫瘤細胞的增殖〔7〕。研究發現五味子多糖具有調節與細胞分裂周期相關蛋白的水平，阻滯細胞周期，從而起到抑制腫瘤增殖的功效〔8〕。五味子多糖對腫瘤的防治作用的研究已經成為現階段臨床研究的熱點〔5〕，但是應用于神經系統腫瘤治療的報道并不多見。溫娜等〔9〕的研究顯示五味子多糖通過激活c－Jun N端液酶( JNK)、磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶( p38MAPK)誘導腫瘤細胞凋亡，同時能夠提高細胞內Ca2+濃度，造成線粒體膜電位下降，促進cytochromec的釋放，提高caspase－9的活性。

cyclin B1和DNA損傷誘導的細胞凋亡密切相關〔10〕，是調控細胞由G2期向M期轉換的重要因子之一。c－Myc是目前研究最為廣泛的癌基因之一〔11〕，與多種腫瘤發生發展有關。本研究表明五味子多糖通過抑制cyclin B1與c－Myc的表達起到抑制U251細胞增殖和G2/M期阻滯的作用。

4參考文獻

1汪雪菁，向姝霖，唐海林，等．二烯丙基二硫對人膠質瘤U251細胞增殖及細胞周期的影響〔J〕．實用腫瘤雜志，2014; 29( 2) : 126－32．

2王曉東，陳善成，楊俊葆，等．星形膠質細胞瘤中HSP70的表達及生物學活性〔J〕．中國老年學雜志，2015; 35( 6) : 1477－9．

3孟天嬌，狄烊，姜亞磊，等．五味子多糖抗腫瘤作用的研究〔J〕．吉林醫藥學院學報，2013; 34( 2) : 141－3．

4徐麗．五味子多糖對肝癌小鼠血清IL－6、TNF－α、VEGF表達的干預作用〔J〕．中國實用醫刊，2013; 40( 15) : 18－9．

5韓斌，鄒向明，李大鵬．五味子多糖對乳腺癌MCF－7細胞株生長抑制作用的實驗研究〔J〕．中國實用醫刊，2013; 40( 4) : 1－3．

6許珂玉，肖建英．五味子多糖對甲狀腺癌細胞株SW579凋亡及survivin表達的影響〔J〕．吉林大學學報(醫學版)，2011; 37( 2) : 279－83，后插2．

7許娜，賴一鳴，陳曉潔，等．五味子多糖誘導SKOV3細胞凋亡及分子機制研究〔J〕．時珍國醫國藥，2013; 24( 5) : 1165－6．

8陸兔林，吳楊，季德，等．五味子多糖提取分離和藥理作用研究進展〔J〕．中國中藥雜志，2014; 39( 4) : 751－4．

9溫娜，唐澤波，袁瑞，等．五味子粗多糖對腦膠質瘤細胞生長的作用〔J〕．中國老年學雜志，2013; 33( 12) : 2837－8．

10 Chen H，Huang Q，Dong J，et al．Overexpression of CDC2/CyclinB1 in gliomas，and CDC2 depletion inhibits proliferation of human glioma cells in vitro and in vivo〔J〕．BMC Cancer，2008; 8: 29．

11 Wang C，Lisanti MP，Liao DJ．Reviewing once more the c－myc and Ras collaboration: converging at the cyclin D1－CDK4 complex and challenging basic concepts of cancer biology〔J〕．Cell Cycle，2011; 10 ( 1) : 57－67．

〔2015－06－11修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者:亢建民( 1964－)，男，博士，主任醫師，主要從事內窺鏡微侵襲神經外科、膠質瘤外科治療研究。

基金項目:天津市自然科學基金項目( No．14JCZDJC35600)

〔中圖分類號〕R730

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202( 2016) 02-0299-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 021