TGF-β3在關節軟骨組織工程的研究進展

劉登榜，鄧江

(1遵義醫學院，遵義563000；遵義醫學院第三附屬醫院)

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TGF-β3在關節軟骨組織工程的研究進展

劉登榜，鄧江

(1遵義醫學院，遵義563000；遵義醫學院第三附屬醫院)

骨關節炎目前尚無有效治療方法。轉化生長因子-β3(TGF-β3)是轉化生長因子超家族蛋白之一，可與生物支架聯合誘導細胞成軟骨分化，可誘導骨髓間充質干細胞、軟骨細胞、脂肪間充質干細胞、滑膜間充質干細胞等種子細胞成軟骨分化，可與成纖維細胞生長因子、胰島素樣生長因子、骨形態發生蛋白等其他生長因子聯合促進軟骨細胞生長，在骨關節的軟骨生長和重建中起著關鍵性的作用。

轉化生長因子-β3；關節軟骨；骨關節炎；成軟骨分化

骨關節炎以關節軟骨退行性病變為主要臨床特點，以往臨床主要采用軟骨下骨鉆孔方法來修復軟骨[1]，但效果較差。目前自體或異體軟骨、骨膜移植及干細胞治療是骨關節炎的研究熱點。轉化生長因子-β3(TGF-β3)是細胞因子中TGF家族的主要成員之一，可促進軟骨細胞的增殖分化、促進細胞外基質形成，抑制IL-1、MMPs 和TNF-α等多種炎性介質的活性，降低機體免疫反應，在創傷修復方面發揮重要作用，尤其在軟骨的生長和重建中起關鍵作用[2，3]，在骨關節炎關節軟骨的修復中具有廣闊的應用前景。以往臨床常使用自體軟骨移植術修復損傷軟骨，但取材有限。近年研究發現，體外增殖誘導干細胞培養可作為補充軟骨缺損的有效方法[4]。TGF-β3可誘導細胞成軟骨分化，誘導分化培養差別可能與細胞種類、種植密度和細胞代數等選擇有關聯。目前用于體外培養的細胞很多，主要包括有來源于骨髓、軟骨、脂肪、滑膜、肌肉、胚胎等多能干細胞。本文就近年來國內外對TGF-β3修復骨關節軟骨的研究進行綜述。

1　TGF-β3的生物學結構功能及其分布

TGF-β有3個亞型分別為TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3。TGF-β是一類多功能蛋白質，可以影響多種細胞的生長分化、細胞凋亡及免疫調節等功能。TGF-β的3種亞型均是以同型二聚體形式、分子量約75 kDa的前體蛋白組裝合成[5]，在pH降低、酸化、蛋白酶催化等情況下被催化裂解出兩部分。一部分是由二硫鍵連接的二聚體前體肽，又稱作前體相關蛋白(LAP)；另一部分是從LAP羧基端裂解下來的成熟TGF-β3，分子質量大小約24 kDa，由兩個結構相同、分子質量約12 kDa的單體通過二硫鍵交聯組成。裂解前的TGF-β3前體蛋白呈非活性狀態，與LAP之間由高親和力的非共價鍵連接，LAP起著保持TGF-β非活性狀態作用，只有兩者分離后，TGF-β3才發揮生物學活性。TGF-β3分泌后，形成大的潛在復合物(LLC)以共價鍵連接并儲存于細胞外基質(ECM)，該復合物包括潛在TGF-β3結合蛋白(LTBP)、mTGF-β3前體蛋白、LAP三部分。

TGF-β3被機體多種細胞表達，在胎盤、脂肪組織、胚胎、肝臟、骨及骨髓、腫瘤等中都有其分布，以自分泌和旁分泌的形式分泌至胞外。TGF-β3在胞外作為配體，通過結合到細胞膜表面的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體介導，再通過胞內SMAD信號通路激活轉錄因子Smad2/Smad3，激活Smad4并與之結合成為復合體，后者移位至細胞核，調控下游TGF-β3基因轉錄表達，行使其生物學功能。

2　TGF-β3在誘導軟骨分化中的作用

2.1TGF-β3與生物支架目前,用于替代向軟骨生長的類軟骨基質主要分為非人工合成材料(自體或異體軟骨、脫鈣骨基質DBM、膠原蛋白、透明質酸、藻酸鹽等)和人工合成材料。自體軟骨無免疫性，但取材少，對軟骨缺損面積較大的修復較困難。異體軟骨能解決大面積缺損，但免疫反應強，修復效果差。目前人工合成的組織材料逐步發展成熟，主要是模擬軟骨基質成分，通過離心沉淀、冷凍干燥等理化方法構建的軟骨組織工程支架，旨在提供體內外干細胞黏附增殖和干細胞向軟骨分化、再生的微環境，達到在生化結構和物理力學性能方面與正常生長軟骨相近的組織材料，支架材料主要有羥基磷灰石(n-HA)、殼聚糖(cs)、絲素蛋白(SF)、聚乳酸(PLA)等。但是，人工支架材料存在生物組織相容性、機械力學、免疫排斥等不足。有學者[6]分別將TGF-β3和人脫鈣骨基質(DBM)植入動物關節軟骨缺損模型中，發現TGF-β3轉染后的骨髓間充質干細胞(BMSC)能顯著的增加DBM上的軟骨生成量，同時還大大增加了COL(Ⅱ)，COL(X)和Aggrecan的產生。TGF-β3與上述材料向成軟骨分化，研究從解剖學證實較滿意地修復了軟骨缺損，而在組織學上與正常的軟骨組織還是有差別，修復組織呈纖維軟骨改變，最終軟骨細胞終末分化，修復效果不佳[7,8]。Pei等[9]從軟骨組織中提取脫細胞軟骨基質(DECM)作為體外細胞生長所需的立體微環境，用于干細胞的增殖分化培養，更近似地向軟骨形成。DECM來源于自身軟骨組織，更接近其軟骨細胞表型，所含膠原、蛋白聚糖等成分幾乎沒改變，成分量較正常軟骨基質稍少。作為干細胞黏附的載體，可被認為是一種具有發展前景的理想組織支架。單純使用細胞生長因子、體外生物支架及干細胞誘導分化來促使軟骨細胞增殖及表達，脫離了正常軟骨形成分化的過程，研究還需從類似軟骨形成的自身微環境出發。

2.2TGF-β3與種子細胞臨床早期使用自體軟骨移植術修復軟骨，但取材有限。研究發現，體外增殖誘導培養干細胞可解決大面積軟骨缺損來源。種子細胞來源豐富，一定條件下具有成軟骨分化潛能的特性，均能表達蛋白聚糖及Ⅱ型膠原成分，對軟骨的修復具有重要作用。然而隨著細胞的傳代，細胞向肥大增生及去分化方向發展，修復的軟骨呈纖維樣軟骨改變[7,10]。可能與細胞分化的發生發育以及細胞因子的多因素調控有關。誘導干細胞成軟骨分化的細胞因子很多。TGF-β3可誘導細胞成軟骨分化，誘導方法分為外源性誘導和內源性誘導。誘導分化培養差別可能與細胞種類、種植密度和細胞代數等選擇有關聯。目前用于體外分化培養的細胞很多，主要包括有來源于骨髓、軟骨、脂肪、滑膜、肌肉、胚胎等多能干細胞。

2.2.1BMSCBMSC是一類運用較廣泛的多潛能干細胞，取材方便，具有良好的多向誘導分化潛能，不同條件下可分別向成軟骨細胞、成骨細胞、成脂肪細胞分化，是目前研究最多的種子細胞。但骨髓中BMSC含量極少，不足0.01%[11]。通過體外傳代培養，純化增殖干細胞。至今尚未發現BMSC其特異性表面抗原標志物[12]，現常見分離純化方法主要包括貼壁篩選法和密度梯度離心篩選法。也有從外周血提取間充質干細胞的報道[13]。胰島素樣生長因子、成纖維細胞生長因子、TGF-β家族等均具有促進骨髓干細胞成軟骨分化。早期實驗認為,TGF-β1在BMSC成軟骨細胞誘導方面起著重要的作用[14];Barry等[15]研究發現,TGF-β3、TGF-β2較TGF-β1成軟骨誘導作用更佳。使用BMSC成軟骨分化的實驗研究已屢見不鮮，然而針對其培養基、血清濃度及誘導成分目前沒有一個較統一的要求，成軟骨細胞標志物表達也不相互一致。BMSC成軟骨分化是一個復雜的過程，很多因素決定其轉歸，主要包括高密度細胞培養和球團培養。但是，目前BMSC仍是研究最成熟的種子細胞。

2.2.2軟骨細胞軟骨細胞是最早用于軟骨組織工程的種子細胞[16],優點是來源于人體，無免疫排斥反應。但軟骨細胞的培養較其他干細胞取材不便，獲取細胞少,體外培養困難。隨著傳代培養，細胞易去分化肥大化，表達Ⅱ型膠原、蛋白聚糖等軟骨標志物較少。臨床上采用自體軟骨細胞移植技術修復軟骨，但由于軟骨細胞獲取困難，需對患者兩次行創傷性手術及供體部位病變等因素受到限制。有研究表明，共同培養軟骨細胞和間充質干細胞能夠增強軟骨表型和TGF-β3的敏感性[17]。基于軟骨細胞的起源提出了軟骨前體干細胞的假說，研究表明軟骨前體干細胞能向軟骨表型系譜分化[18]，并持續到成年期，但需要進一步實驗闡釋。國內丁然等[19]證實,TGF-β3較TGF-β1、TGF-β2對于誘導前軟骨干細胞的增殖和成軟骨分化的正向調節作用更為顯著。TGF-β3還可以調節TGF-β1與TGF-β2的比例,抑制成纖維細胞的增生,減緩細胞纖維化進程[20]。

2.2.3脂肪間充質干細胞脂肪來源間充質干細胞來源于中胚層，可以多向誘導分化，具有易獲得，來源豐富、增殖能力強等優點,逐漸成為組織工程領域研究熱點。有學者認為，脂肪干細胞較骨髓來源干細胞易取材、培養，更接近向軟骨細胞表型分化[21]。但是也有研究觀點與其相悖[22～24]，認為脂肪干細胞向軟骨細胞分化的能力弱，分泌軟骨基質及Ⅱ型膠原的能力低于BMSC。有學者發現，TGF-β3與骨形態發生蛋白(BMP)-6聯合培養更能增加脂肪間充質干細胞向軟骨細胞分化的潛能[25,26]。作者認為，脂肪間充質干細胞已屬干細胞二級分化，多向脂肪分化轉歸，較BMSC成軟骨分化的潛能弱。

2.2.4滑膜間充質干細胞有研究證實，體外培養滑膜間充質干細胞相比BMSC、骨膜細胞、脂肪間充質干細胞等有更好的增殖活性和成軟骨能力[27]。更為重要的是，理論上滑膜間充質干細胞來源的軟骨細胞和關節軟骨細胞具有相似的基因表達譜。軟骨的形成起于骨干兩端骺軟骨的第二骨化中心，滑膜間充質干細胞分泌的細胞外基質可以推遲軟骨細胞去分化衰老，并可以增強其向軟骨細胞再分化能力[28]?；らg充質干細胞與多層軟骨細胞片共培養后植入兔骨軟骨缺損，研究顯示能夠有效地修復軟骨[29]。Li等[30]結合缺氧條件，在含有成纖維生長因子-2作為誘導的組織特異性細胞外基質中培養滑膜間充質干細胞可高效促進其增殖，并且可以下調肥大增生標記基因的表達，在體外三維微環境下基于干細胞的軟骨缺損的修復提供了高質量的干細胞。

3　TGF-β3與其他生長因子

細胞因子是軟骨發生發育中必不可少的成分。除了TGF-β3可調節關節軟骨的生長發育，成纖維細胞生長因子、胰島素樣生長因子，BMP家族等。胰島素樣生長因子是第一個被發現的可以調控軟骨形成的多肽，促進干細胞向軟骨細胞分化，增加軟骨細胞外基質的合成，減慢基質降解并抑制軟骨細胞的凋亡[31]。早期的細胞成軟骨分化，不是由單個因子所控制的，而是多個細胞因子共同參與促進其向軟骨表達。有研究表明添加BMP-2能明顯促進體外TGF-β3誘導培養滑膜間充質干細胞向軟骨細胞分化[32]。聯合轉染多種成軟骨分化的生長因子的研究也在一定程度上修復了軟骨缺損，但最終避免不了軟骨的退化?；罨疶細胞核因子(NFAT)被發現于T細胞內一種與人IL-2啟動子相結合，依賴Ca2+/鈣調神經磷酸酶(CaN)的核轉錄因子,包括NFATc1、NFATc2、NFATc3、 NFATc4及TonEBP共5個亞型[33]。CaN是絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族成員。CaN主要表達于細胞質中,組織分布廣泛，通過使底物NFAT去磷酸化和核內轉位，調劑下游基因的轉錄和表達。在免疫細胞的免疫應答中對細胞因子的基因和其他基因的轉錄發揮重要的作用。非免疫系統通過去磷酸化和核內轉位發揮功能調節作用。大量研究表明，CaN/NFAT信號通路不僅參與多種免疫系統疾病的發生發展，調控腫瘤發生過程的基因轉錄表達，介導心肌肥大的病理生理過程，還參與破骨細胞的分化。最近有研究表明，NFAT在調控關節軟骨合成代謝和分解代謝的平衡和抑制軟骨細胞過度增生肥大化方面起著關鍵性的作用[34]。

4　展望

目前，TGF-β3介導基因表達的機制已有多種途徑的報道，被大部分學者接受的是胞內SMAD通路上調其靶向基因表達，再通過旁分泌和自分泌蛋白修復關節軟骨損傷。而研究NFAT依賴CaN磷酸化后再經過核轉位和其他蛋白共同調節下游靶基因TGF-β3的表達，促進軟骨基質合成分泌，同時抑制促軟骨分解的炎性因子對軟骨進一步的損害。因此，在SMAD信號通路和NFAT之間可能存在有一定的共同聯系，有待進一步證實研究。臨床上用于關節軟骨損傷修復的方法均有不同程度的局限性，國內外TGF-β3治療軟骨已奠定了一定的基礎，在此基礎上優化軟骨組織支架，篩選出組織特異性的種子細胞，結合基因工程研究，相信對組織工程修復軟骨將帶來新的希望。

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鄧江(E-mail: DJ30666@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.18.040

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2015-12-15)