響應面分析法對蒲公英藥材中有機酸類成分提取工藝的優化

焦紅軍，許真真

(鄭州大學第二附屬醫院，鄭州450001)

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·藥學研究·

響應面分析法對蒲公英藥材中有機酸類成分提取工藝的優化

焦紅軍，許真真

(鄭州大學第二附屬醫院，鄭州450001)

目的探討響應面分析法優化蒲公英藥材中有機酸類成分的提取工藝。方法采用高效液相色譜法，以綠原酸、咖啡酸及阿魏酸含量為測定指標，通過響應面分析法考察溶劑濃度、液料比、提取時間對提取工藝的影響，對結果進行二項式回歸模型擬合，優化提取工藝。結果最佳提取工藝乙醇濃度為62.88%，料液比為16.17∶1，提取時間為 65.42 min，回流提取2次，總評歸一值預測值為0.982 0；實際測得綠原酸、咖啡酸及阿魏酸提取量分別為771.2、472.4、28.5 μg/g，總評歸一值為0.979 8，與理論預測值差異無顯著性(P>0.05)。結論響應面分析法能較好地擬合蒲公英藥材中綠原酸、咖啡酸及阿魏酸提取工藝，所預測值與試驗值吻合較好。

響應面分析法；蒲公英；綠原酸；咖啡酸；阿魏酸；提取工藝

蒲公英的主要有效成分為綠原酸、咖啡酸及阿魏酸等有機酸類[1～4]，但尚缺乏對其的有效開發與利用。在以往中藥材的提取工藝研究中，正交實驗設計優化提取工藝居多[5～7]，但實驗結果不精確。響應面分析方法是采用二項式模型，擬合值更接近真實值。2015年3～6月，我們利用響應面分析法，以綠原酸、咖啡酸及阿魏酸提取率的總評歸一值為質控指標，優選蒲公英藥材有機酸類成分的提取條件。

1　儀器與試藥

蒲公英藥材經鑒定為為菊科植物蒲公英、堿地蒲公英或同屬種植物的干燥全草。2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)，2998 紫外檢測器(美國Waters公司)；小型超聲波清洗機KM-615A(廣州市科潔盟實驗儀器有限公司)，CPA225D十萬分之一天平(德國賽多利斯)；綠原酸、咖啡酸、阿魏酸對照品購于中國藥品生物制品檢定所，乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2　方法與結果

2.1綠原酸、咖啡酸及阿魏酸測定方法的建立

2.1.1蒲公英的提取取蒲公英粗粉10 g，將蒲公英提取液濃縮，用甲醇定容至25 mL；精密吸取5 mL，用甲醇溶解并定容至25 mL；用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液即得。

2.1.2色譜條件采用Agilent C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以乙腈(A)-0.1%磷酸水(B) 為流動相，梯度洗脫(0～15 min，12% A；15～40 min，12%～32% A)，柱溫25 ℃，流速1.0 mL/min，檢測波長320 nm。理論塔板數按綠原酸峰計算不低于3 000 ng。

2.1.3對照品溶液的制備稱取綠原酸對照品0.723 mg、咖啡酸對照品0.421 mg,吸取34 μg/mL阿魏酸對照溶液1 mL，置10 mL容量瓶中；加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.1.4線性關系分析吸取上述混合對照品溶液2、5、10、15、20 μL，注入色譜儀；以進樣量為自變量，色譜峰面積為因變量，繪制標準曲線，建立回歸方程：y=1 725.8x+22 047，r=0.999 5，y=2 578.2x+11 342，r=0.999 4，y=1 201.4x+693.1，r=0.999 1。提示綠原酸、咖啡酸及阿魏酸分別在144.6～1 446 ng、84.2～842 ng、6.8～68 ng內線性關系良好。

2.2單因素試驗

2. 2. 1乙醇濃度的影響取蒲公英粗粉10 g，選擇0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇作為提取溶劑，液料比為 20∶1，回流提取 60 min，提取2次；按2.1.2項條件測定。結果60%乙醇濃度時，有機酸類成分提取量較高，故選擇60%乙醇作為提取溶劑。

2.2.2液料比的影響取蒲公英粗粉10 g，以 60% 乙醇作為提取溶劑，提取時間為60 min，以5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1的料液比，進行回流提取，提取次數2次，按2.1.2項條件測定。結果料液比15∶1對提取量的影響較小，故選擇15∶1作為料液比。

2.2.3提取時間的影響取蒲公英粗粉10 g，以 60% 乙醇作為提取溶劑，液料比為 15∶1，回流提取 60 min，提取2次，以提取時間為 20、40、60、80、100、120 min 進行回流提取，按2.1.2項條件測定。結果60 min后提取時間對提取量的影響較小，故選擇60 min作為提取時間。

2.3響應面分析法優選提取工藝

2.3.1回歸模型建立及方差分析通過單因素試驗，確定以乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)為考察因素，響應面試驗設計水平分為-1、0、1，設計三因素三水平17個試驗點的響應面分析。以綠原酸、咖啡酸及阿魏酸提取量進行綜合考量，得總評歸一值(OD)[8]。采用Design Expert軟件處理，逐步遞減回歸，以P<0.05為標準得OD值的回歸方程為OD=-10.574 539+0.336 41A+0.0872 57B+7.790 78×10-3C-1.814 91×10-5AB+1.394 23×10-5AC-1.102 23×10-4BC-2.680 21×10-3A2-2.440 50×10-3B2+5.260 72×10-5C2。對OD值模型進行方差分析，結果回歸模型極其顯著(P<0.000 1)。模型的一次項中A顯著，二次項A2和B2影響為顯著，提示所選各因素對結果的影響排序為乙醇濃度>液料比>提取時間。

2.3.2最佳提取工藝的驗證以OD值為考核指標，蒲公英藥材中有機酸類的最佳提取工藝為: 乙醇濃度為62.88%，料液比為 16.17∶1 ，提取時間為 65.42 min，此條件下的OD值預測值為0.982 0。結合實際試驗，將溶劑濃度定為 63%，料液比定為16∶1，提取時間定為 65 min，提取2次，實際測得綠原酸、咖啡酸及阿魏酸提取量分別為771.2 μg/g、472.4 μg/g、28.5 μg/g，OD值為0.979 8，這與理論預測值差異無顯著性(P>0.05)。

3　討論

蒲公英為中國傳統中藥材，具有較強的抗菌、抗腫瘤、利尿作用[9～11]。蒲公英的研究文獻較少，其提取工藝研究報道甚少。本文通過響應面分析方法研究蒲公英藥材中有機酸類成分的提取工藝，篩選最佳的提取工藝。首先，本實驗通過檢測蒲公英藥材中有機酸類成分的含量，建立了其質量控制指標的檢測方法。綜合考察蒲公英主要有效成分綠原酸、咖啡酸及阿魏酸含量，來衡量蒲公英提取工藝，結果更為合理。從試驗結果顯示，乙醇濃度、料液比、提取時間為蒲公英藥材中有機酸成分提取工藝的影響因素，3個因素之間相互影響，對最終結果的貢獻不是常規意義上的線性模型[12,13]。因此，如果采用正交設計提取工藝，結果失真。響應面分析法設計的原理是擬合二項式模型方程，以相應面優化提取條件，盡最大程度地擬合真實值，從而縮小了預測值與真實值的差異，結果更可信。本研究提取過程中，綠原酸、咖啡酸及阿魏酸含量往往相互影響，因此需要采綜合模式進行優化；OD值正是將有機酸類成分的提取率綜合作為指標，與提取條件構成響應面，篩選最佳工藝。

因此，響應面分析法能較好地擬合蒲公英藥材中有機酸類成分的提取工藝，二項式擬合模型更靠近真實情況。最終，通過響應面分析法，確定最佳提取工藝，63%乙醇濃度，16∶1的料液比，提取時間65 min，回流提取2次。這為工業化生產合理利用蒲公英資源提供了理論依據，并且為擴大蒲公英的應用與開發提供了一定的理論基礎和參考。

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河南省教育廳科學技術研究重點項目(14A350014)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.18.036

R917

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1002-266X(2016)18-0092-02

2015-10-18)