4種化學小分子聯合誘導鼠胚胎成纖維細胞轉化為施旺細胞效果觀察

王永輝，楊瓊，徐輝明，高維強

(1上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院，上海200217;2上海交通大學Med-X臨床干細胞研究中心)

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4種化學小分子聯合誘導鼠胚胎成纖維細胞轉化為施旺細胞效果觀察

王永輝1,2，楊瓊1,2，徐輝明1,2，高維強1,2

(1上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院，上海200217;2上海交通大學Med-X臨床干細胞研究中心)

目的觀察轉化生長因子-β抑制劑SB431542、骨形態發生蛋白抑制劑Noggin、腺苷酸環化酶抑制劑FSK、 組蛋白去乙酰化酶抑制劑丁酸鈉聯合誘導鼠胚胎成纖維細胞(MEF)轉化為施旺細胞的效果。方法將孕13.5 d雌鼠處死后取胎鼠分離MEF細胞，分為觀察組和對照組；觀察組置于含10 ng/mL堿性成纖維細胞生長因子、20 ng/mL表皮細胞生長因子、 20 ng/mL膠質細胞源性神經營養因子、 5 μmol/L 全反式維甲酸、10 μmol/L SB431542、200 ng/mL Noggin、10 μmol/L FSK、0.2 mmol/L丁酸鈉的neurobasal培養基中誘導培養，隔天換液，共誘導3周,對照組不處理。在倒置相差顯微鏡下觀察并記錄兩組轉化細胞的形態，采用Q-PCR法檢測兩組施旺細胞標志物S100β、人蛋白脂質蛋白抗體(PLP)mRNA。結果誘導培養3周后可見部分MEF細胞變成梭形，胞體較小，兩側突起纖長，呈旋渦狀排列。觀察組S100β、PLP mRNA相對表達量分別為34.100±5.657、18.980±2.031，對照組分別為0.985±0.015、0.995±0.005(P均<0.05)。結論SB431542、Noggin、Forskolin和丁酸鈉聯合可誘導鼠胚胎MEF轉化為施旺細胞。

大鼠；胚胎；成纖維細胞；施旺細胞；轉化生長因子-β；骨形態發生蛋白；腺苷酸環化酶；組蛋白去乙酰化酶

脊髓損傷是脊柱損傷最嚴重的并發癥，可導致損傷節段以下肢體嚴重功能障礙，目前臨床尚無有效治療方法。施旺細胞是周圍神經主要的支持細胞，具有神經傳導、神經保護、神經再生及神經營養作用[1,2]。最新研究發現，施旺細胞可促進損傷脊髓神經細胞修復[2～4]，但具有再生困難等缺點。自體細胞直接誘導分化為施旺細胞是目前的研究熱點[5]。S100β和人蛋白脂蛋白抗體(PLP)是施旺細胞的特異表達基因。2014年12月～2015年12月，我們觀察了轉化生長因子-β(TGF-β)抑制劑SB431542、骨形態發生蛋白(BMP)抑制劑Noggin、腺苷酸環化酶(cAMP)抑制劑FSK、 組蛋白去乙酰化酶抑制劑丁酸鈉聯合誘導鼠胚胎成纖維細胞(MEF)轉化為施旺細胞的情況，旨在為脊髓損傷的細胞治療提供參考。現報告如下。

1　材料與方法

1.1材料孕13.5 d的C57B1/6的雌性大鼠5只，體質量25～35 g,購自上海斯萊克公司；兔抗S100β單克隆抗體及兔抗PLP多克隆抗體均購自艾美捷公司，TAKARA逆轉錄試劑盒及核酸凝膠染料(SBYR Green)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮細胞生長因子(EGF)、膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)，全反式維甲酸(RA)、SB431542、Noggin、FSK、丁酸鈉等材料購自R&D system和Sigma公司，其余儀器購自Applied Biosystems公司, 10 % 胎牛血清(FBS)和1%青霉素-鏈霉素(P-S)購自Life technology公司。

1.2MEF細胞的分離將孕13.5 d雌鼠處死后取胎鼠，根據文獻[6]方法分離MEF，去除胎鼠的脊髓以避免殘留的神經干細胞及神經元的干擾。用含有10 % FBS和1% P-S的DMEM培養基在37 ℃、5% CO2培養箱中培養至第2代備用。

1.3細胞誘導培養取適量MEF，當細胞融合至80%～90%時傳代至多聚賴氨酸預處理的培養皿和圓玻片上，第2天時吸出MEF培養基，PBS沖洗1次，置于含10 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF、 20 ng/mL GDNF、 5 μmol/L RA、10 μmol/L SB431542、200 ng/mL Noggin、10 μmmol/mL FSK、0.2 mmol/L丁酸鈉的neurobasal培養基中，37 ℃、5% CO2環境下誘導培養，隔天換液，共誘導3周。

1.4細胞特性鑒定

1.4.1細胞形態觀察取適量細胞，用PBS洗3次；4%多聚甲醛固定15 min，3%牛血清白蛋白封閉 1 h，再用一抗4 ℃孵育過夜。PBS洗3～5次，然后用相應的二抗室溫避光孵育1 h。PBS洗3～5次,DAPI孵育3 min。封片后在倒置相差顯微鏡下觀察，記錄轉化細胞的形態。

1.4.2細胞S100β、PLP mRNA檢測 采用Q-PCR法。取適量誘導3周的MEF細胞(觀察組)、方法1.2中分離的MEF細胞(對照組)，PBS沖洗1次，提取總RNA，反轉錄生成1 μg cDNA，所有操作嚴格按照使用說明書進行。利用ABI PRISM 7900熒光實時定量PCR儀對擴增數據進行收集，并利用ABI公司的SDS2.3軟件進行數據分析。以GAPDH為內參對照，采用ΔCt法計算兩組細胞S100β、PLP mRNA相對表達量，實驗重復3次。

2　結果

誘導培養3周后,可見部分MEF細胞變成梭形，胞體較小，兩側突起纖長，呈旋渦狀排列。觀察組S100β、PLP mRNA相對表達量分別為34.100±5.657、18.980±2.031，對照組分別為0.985±0.015、0.995±0.005，觀察組S100β、PLD mRNA相對表達量均高于對照組，P均<0.05。

3　討論

神經細胞再生困難,多能干細胞[包括胚胎干細胞和誘導型多能干細胞(iPS)]分化、體細胞轉分化是目前研究熱點。施旺細胞主要分布在周圍神經系統中神經元的突起周圍，細胞形狀不規則；其是周圍神經纖維的鞘細胞，可反復包裹周圍神經纖維的軸突形成髓鞘。研究發現，施旺細胞外表面有一層基膜，在周圍神經再生中起重要作用[7, 8]。研究發現，脂肪干細胞[9]、間充質干細胞[10]和iPS[11]均可誘導分化為施旺細胞，但分化效率低，且iPS具有高致瘤性[12]。Vierbunchon等[6]通過病毒載體表達轉錄因子Ascl1、Brn2和Myt1l成功將MEF轉分化為神經細胞，但病毒載體可導致基因組整合，染色體不穩定，最終導致細胞癌變。既往研究發現，化學小分子可將人體細胞直接轉分化為神經元[16]和神經膠質細胞[5]。Thoma等[5]使用多種化學小分子成功將成纖維細胞轉化為神經嵴細胞, 然后再進一步分化為施旺細胞。我們前期研究成功將MEF轉分化為GABA能神經元[12，13]。

在施旺細胞的發育過程中，TGF-β會導致施旺細胞凋亡[17]。有實驗證明，在神經元與施旺細胞共培養的體系中，TGF-β1可抑制樹突與施旺細胞之間的信號傳導，最終抑制施旺細胞增殖，抑制髓鞘的形成[18]。因此，本研究采用TGF-β抑制劑SB431542來抑制施旺細胞凋亡、促進施旺細胞增殖及髓鞘形成。而Noggin可通過抑制BMP，促進神經干細胞的增殖[19，20]。cAMP在抑制施旺細胞的增殖和分化成髓鞘細胞的過程中均起重要作用[21]，而FSK可通過抑制其來降低cAMP水平；丁酸鈉是將成纖維細胞轉分化為施旺細胞誘導培養基中非常重要的成分[5]。另外，我們的培養體系中還添加了生長因子RA，原因是RA在神經系統形成、神經元的特化以及軸突生長過程中均起重要作用[22]。既往研究發現施旺細胞表面存在RA受體，提示RA在病理情況下和軸突的生長及再生發揮重要作用。此外，bFGF、GDNF和EGF均可促進神經系統髓鞘形成[23]。

綜上所述，SB431542、Noggin、FSK和丁酸鈉聯合可誘導鼠胚胎MEF轉化為施旺細胞，但其具體機制尚有待于進一步研究。

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國家自然科學基金資助項目(31571399)。

高維強(E-mail: gao.weiqiang@sjtu.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.18.010

R329.2

A

1002-266X(2016)18-0032-03