缺氧條件下ADAM17-shRNA對人乳腺癌MCF-7細胞侵襲、遷移的影響

蔡準，張媛媛，張雪鵬，吳春濤，胡寶山

(華北理工大學附屬醫院，河北唐山063000)

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缺氧條件下ADAM17-shRNA對人乳腺癌MCF-7細胞侵襲、遷移的影響

蔡準，張媛媛，張雪鵬，吳春濤，胡寶山

(華北理工大學附屬醫院，河北唐山063000)

目的觀察缺氧條件下靶向解聚素-金屬蛋白酶17(ADAM17)的短發夾RNA(shRNA)對人乳腺癌細胞MCF-7侵襲及遷移能力的影響。方法將對數生長期的MCF-7隨機分為觀察組、對照組、空白組，分別使用ADAM17-shRNA、無義序列shRNA、等量PBS轉染細胞，置于含10%血清及氯化鈷的培養基中(模擬缺氧環境)培養。轉染48 h采用Real-time PCR法檢測各組ADAM17 mRNA表達，體外侵襲實驗檢測細胞侵襲能力，細胞劃痕實驗檢細胞遷移能力。 結果轉染后觀察組、對照組、空白組ADAM17 mRNA的相對表達量分別為0.77±0.19、1.19±0.22、1.00±0.01，觀察組低于對照組和空白組，P均<0.05。轉染后觀察組、對照組、空白組穿膜細胞數分別為(37.94±4.97)、(94.84±5.39)、(100.60±5.45)個，觀察組低于對照組和空白組，P均<0.05。轉染后觀察組、對照組、空白組劃痕愈合率分別為23.49%±1.68%、57.83%±2.91%、57.02%±2.73%，觀察組低于對照組和空白組，P均<0.05。結論缺氧條件下ADAM17-shRNA可抑制MCF-7的侵襲和遷移能力。

乳腺癌；缺氧條件；解聚素-金屬蛋白酶17；短發夾RNA ；細胞侵襲；細胞遷移

解聚素-金屬蛋白酶(ADAM)是一類具有多種生物學功能的細胞膜表面糖蛋白家族，與腫瘤的發生、侵襲和轉移密切相關[1]。ADAM17是研究最多的ADAM家族成員之一，是一種蛋白剪切酶，可通過剪切細胞膜外蛋白功能區使功能區脫落，啟動或釋放許多結構和功能不同的分子，從而調節細胞的增殖、運動能力等生物學行為[2,3]。本課題組前期研究結果表明，正常環境下靶向沉默ADAM17可抑制人乳腺癌MCF-7細胞的侵襲及遷移[4]。2014年9月～2015年10月，我們觀察了缺氧條件下靶向ADAM17的短發夾RNA(ADAM17-shRNA)對人乳腺癌細胞株MCF-7侵襲和遷移的影響，旨在為ADAM17成為乳腺癌靶向治療的新靶點提供依據。

1　材料與方法

1.1材料MCF-7購自中國醫學科學院天津血液學研究所，培養于含10%標準胎牛血清、150 μmol/L氯化鈷[5]、50 U/mL青霉素、50 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基中，培養條件為37 ℃、5%CO2。主要試劑：DMEM 高糖培養基、0.25%胰蛋白酶(Hyclone公司)；標準胎牛血清(Gibico公司)；六合水氯化鈷(Sigma公司)；Matrigel基質膠、Transwell小室(BD公司)；shRNA-ADAM17(上海吉瑪公司合成)；Lipofectamine2000、SYBR Green qPCR試劑盒、TRIzol、反轉錄試劑盒均來自Invitrogen公司，引物的設計與合成均由Invitrogen公司合成。主要儀器： 生物安全柜(海爾公司)；CO2孵育箱(Forma Scientifi公司)；倒置相差顯微鏡(Nikon)；熒光顯微鏡(Olympus公司)；高速冷凍離心機(Sigma公司 )；Rotor-Gene3000熒光定量PCR 儀(Gene Company Iimited公司)。

1.2細胞分組及轉染取適量對數生長期MCF-7接種于6孔板中，分為觀察組、對照組、空白組，每組6個復孔，待細胞融合度達90%以上時分別使用ADAM17-shRNA、無義序列shRNA、等量的PBS轉染細胞，置于含10%血清及氯化鈷的培養基中培養(模擬缺氧環境)，所有操作均嚴格按照使用說明書進行，熒光顯微鏡下觀察轉染效率80%以上則視為轉染成功。

1.3MCF-7細胞ADAM17 mRNA表達檢測采用Real-time PCR法。轉染48 h取適量各組細胞，用TRIzol法提取總RNA，反轉錄試劑盒合成cDNA，所有操作嚴格按照使用說明書進行。以β-actin為內參，上游引物：5′-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3′，下游引物：5′-AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA-3′；ADAM17上游引物：5′-ATCAAACCCTTTCCTGCG-3′，下游引物：5′-CAAACCCATCCTCGTCCA-3′。反應體系(上游引物 0.5 μL、下游引物 0.5 μL、cDNA 1 μL、DEPC水 8 μL、SYBGREEN 10 μL)放入Rotor-Gene3000 PCR儀中進行RT-PCR擴增，擴增條件：95 ℃、15 s，57 ℃、25 s，40個循環。應用分析軟件Rotor-Gene采用2-ΔΔCt相對定量分析法計算各組ADAM17 mRNA的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.4MCF-7細胞侵襲能力觀察采用體外侵襲實驗。轉染48 h取適量各組細胞，常規消化后調整細胞密度為5×105/mL。各取100 μL加入Transwell上層小室，將聚碳酸酯膜切取下來，進行蘇木素染色，用中性樹膠封片。100倍光學顯微鏡下觀察穿膜細胞數后進行拍照，隨機取5個視野，計算出每個視野內穿出膜的細胞數，計算其平均值。實驗重復3次。

1.5MCF-7細胞遷移能力觀察采用細胞劃痕實驗。轉染48 h取適量各組細胞，常規消化后調整細胞密度為5×105/mL。細胞融合率達到100%時用10 μL的槍頭作筆直劃痕，PBS清洗3次，37 ℃、5%CO2培養培養24 h。用Image J軟件分析培養0、48 h時的各組劃痕情況，計算劃痕愈合率[(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%]。實驗重復3次，取平均值。

2　結果

2.1各組ADAM17 mRNA表達比較轉染48 h觀察組、對照組、空白組ADAM17 mRNA的相對表達量分別為0.77±0.19、1.19±0.22、1.00±0.01，觀察組低于對照組和空白組，P均<0.05。

2.2各組穿膜細胞數比較轉染48 h觀察組、對照組、空白組穿膜細胞數分別為(37.94±4.97)、(94.84±5.39)、(100.60±5.45)個，觀察組低于對照組和空白組，P均<0.05。

2.3各組劃痕愈合率比較轉染48 h觀察組、對照組、空白組劃痕愈合率分別為23.49%±1.68%、57.83%±2.91%、57.02%±2.73%，觀察組低于對照組和空白組，P均<0.05。

3　討論

ADAM是近年新發現的一類細胞膜表面糖蛋白家族，ADAM17是其中一員。研究發現，ADAM17可促進腫瘤血管的形成、細胞增殖及侵襲轉移；可影響腫瘤壞死因子、Notch受體和配體、表皮生長因子受體(EGRF)等多種膜蛋白的成熟釋放；可通過剪切TGF-α啟動EGRF信號通路[6]與Notch信號通路[7]，促使腫瘤細胞的局部或遠處浸潤和轉移。RNA干擾(RNAi)是指與靶基因序列同源的雙鏈RNA所誘導的轉錄后基因沉默現象，已被廣泛用于藥物靶基因的篩選、腫瘤治療等領域[8]。Zheng等[9]構建針對ADAM17的shRNA表達載體轉染人膠質瘤U87細胞，最終發現U87細胞的增殖、黏附和侵襲能力均降低。誘導表達ADAM17-shRNA可導致人胰腺癌細胞增殖和遷移能力降低[10]。因此，抑制ADAM17的表達可不同程度抑制各種腫瘤的侵襲和增殖能力。

本課題組前期研究發現，正常環境下靶向沉默ADAM17能抑制人乳腺癌MCF-7細胞的侵襲及遷移能力[4]。缺氧是人類實體腫瘤中普遍存在的現象，腫瘤細胞的惡性增殖以及腫瘤組織中血管結構的變異都可以引起腫瘤微環境的缺氧[11]。研究發現，三陰性乳腺癌組織中缺氧誘導因子1α(HIF-1α)呈高表達[12，13]。氯化鈷是特異性的HIF-1α誘導劑[14]，故本研究用氯化鈷于模擬體內細胞低氧環境。結果顯示，觀察組ADAM17 mRNA的相對表達量、穿膜細胞數低于對照組和空白組，說明沉默ADAM17可抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移能力。研究表明，shRNA-HIF-1α能抑制舌癌細胞增殖[15]。HIF-1α信號通路和其他信號通路間也存在交叉調節，形成了細胞低氧應答的特異性和多樣性[16]。ADAM17可能與HIF-1α的通路相關，抑制ADAM17D蛋白的表達，可阻止HIF-1α生成的通道，從而降低其侵襲和遷移能力。

綜上所述，缺氧條件下ADAM17-shRNA可抑制MCF-7中ADAM17 mRNA的表達，從而抑制細胞遷移及侵襲能力，以增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，可為于乳腺癌的靶向治療提供新的思路和方法。

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Effects of ADAM17-shRNA on invasion and migration of MCF-7cells in patients with breast cancer under hypoxia

CAIZhun,ZHANGYuanyuan,ZHANGXuepeng,WUChuntao,HUBaoshan

(AffiliatedHospitalofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

ObjectiveTo observe the effects of short hairpin RNA (shRNA) targeting on a disintegrin and metalloproteinase 17 (ADAM17) on the invasion and migration of human breast cancer cells MCF-7 under hypoxia.MethodsMCF-7 cells in the logarithmic phase were divided into the observation group (transfected with ADAM17-shRNA), control group (transfected with ADAM17-nonsense sequence shRNA) and blank group (phosphate-buffered saline, PBS) and then they were all cultured on the medium with 10% FBS (fetal bovine serum) and cobalt chloride. Forty-eight hours after transfection, ADAM17 mRNA expression, invasion and migration abilities of the three groups were detected by real-time PCR, Transwell assay and cell scratch test, respectively. ResultsThe expression of ADAM17mRNA in the observation group, control group and blank group was 0.77±0.19, 1.19±0.22 and 1.00±0.01, respectively. Compared with control group and blank group, the ADAM17 mRNA expression of the observation group was significantly lower (P<0.05). Transwell assay showed the number of MCF-7 cells penetrating into the bottom room through matrigel in the observation group (37.94±4.97) was significantly lower than that in the control group (94.84±5.39) and blank group (100.60±5.45), allP<0.05. Cell scratch test showed that scratch healing rate of the observation group, control group and the blank group was 23.49%±1.68%, 57.83%±2.91% and 57.02%±2.73%, respectively. The healing rate of observation group was significantly lower than that of control group and blank group (allP<0.05). ConclusionThe invasion and migration abilities of human breast cancer MCF-7 cells can be effectively inhibited by ADAM17-shRNA under hypoxia.

breast carcinoma; hypoxic condition; a disintegrin and metalloproteinase 17; short hairpin RNA; cell invasion; cell migration

河北省自然科學基金資助項目(C2010001767);河北省唐山市科學技術研究與發展計劃項目(14130256B)。

蔡準(1986-)，男，碩士研究生在讀，主要研究方向為乳腺癌的綜合治療。E-mail： caizhun1986317@163.com

簡介：張雪鵬(1971-)，男，博士，主任醫師，教授，主要研究方向為乳腺癌的綜合治療。E-mail： syzxp@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.18.002

R737.5

A

1002-266X(2016)18-0005-03

2015-02-23)