茜素黃R與DNA的相互作用

歐亮龍,馬 越,王興明

(1.洛陽軸承研究所有限公司,河南 洛陽 471039;2.洛陽軸研科技股份有限公司,河南 洛陽 471039;

3.西南科技大學 材料科學與工程學院化學系,四川　綿陽 621010)

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茜素黃R與DNA的相互作用

歐亮龍1,馬 越2,王興明3

(1.洛陽軸承研究所有限公司,河南 洛陽 471039;2.洛陽軸研科技股份有限公司,河南 洛陽 471039;

3.西南科技大學 材料科學與工程學院化學系,四川綿陽 621010)

摘要：通過紫外、熒光光譜法、熱力學方法、粘度法等研究了有機小分子茜素黃R(AYR)與鯡魚精DNA(hsDNA)作用的摩爾比，作用方式，結合常數，熱力學參數等.研究結果表明，AYR與DNA的作用摩爾比為4∶1，結合常數K293.65K= 8.63×104 L·mol-1；AYR與DNA的作用模式為靜電作用并且同時存在部分嵌插作用，通過熱力學實驗，結果表明AYR與DNA能夠自發進行作用，并且為熵-焓協同驅動.

關鍵詞：茜素黃R； 鯡魚精DNA； 作用機理

茜素黃R (Alizarin Yellow R, 簡稱 AYR)是從一類茜草植物中發現的染料，一些功能性的醫藥和保健食品中常常會添加.[1]茜素黃 R 是一種茜草類有機小分子植物染料，研究發現這種小分子能夠作為生物探針，通過這種探針可以探索和發現蛋白質的結構也可以深入了解蛋白質的生物功能從而研究兩者之間的聯系[2].本文研究茜素黃R與 DNA的相互作用方式，在新型抗癌藥物的選擇、抗癌功能的緩釋改良以及抗病毒作用機理等方面有重要應用和理論意義.

1實驗部分

1.1試劑與儀器

鯡魚精DNA(hsDNA)，Sigma公司；茜素黃R(Alizarin Yellow R)，成都科龍化工試劑廠；三羥甲基氨基甲烷(Tris)，成都科龍化工試劑廠；吖啶橙(AO)，中國醫藥(集團)上海化學試劑公司.

UV-2102-PCS型紫外可見分光光度計，上海尤尼科有限公司；FL-4500型熒光光譜儀，日本日立公司；烏式貝德粘度計，上海市青浦縣前明玻璃儀器廠；pHS-2C型酸度計，成都方舟科技開發公司.

1.2Tris-HCl生物緩沖溶液的配制

稱取24.225 g三羥甲基氨基甲烷(Tris)，加入約2000 mL的二次蒸餾水，將事先校正好的pHS-2C型酸度計的復合電極插入Tris溶液中，緩慢加入由16.65 mL濃鹽酸加適量水稀釋后的稀鹽酸，不斷攪拌，直到酸度計指示pH值顯示為7.40并且穩定，將配好的Tris-HC1緩沖溶液裝入瓶中備用.

2結果與討論

2.1紫外可見光譜法測定AYR與DNA相互作用的摩爾比

AYR與DNA作用的結合比是用摩爾比法來測試的，測試結果如圖1所示.由圖1可以看出，隨著AYR溶液的加入，體系在210 nm處的吸收峰出現了規律性的增強.說明DNA與AYR發生了相互作用.這在265 nm處和380 nm處的兩個相對較弱的紫外可見吸收峰也同樣的出現了一定范圍內的增強.這可能是因為AYR與DNA之間靜電作用而引起的[3].通過圖1中的延長線交點，通過計算該點位置上AYR與DNA的摩爾比，結果為3.94∶1≈4∶1，所以認為AYR與DNA作用的摩爾比為：nAYR∶nDNA= 4∶1.

2.2AYR與DNA相互作用的熱力學計算

AYR與DNA的結合常數是通過雙倒數法來計算的，通過吸光度反映各個組份的濃度來計算反應平衡常數.公式(1)中的A為吸光度，A0為未加入AYR時的吸光度，K是結合常數，可用下關系式式來描述[4]：

(1)

把式(1)分別代入293.65 K和310.15 K時測定的吸光度值，得到兩條直線，通過對兩條直線分別進行線性回歸，即為雙倒數圖2.

圖1　DNA和AYR作用的摩爾比(263nm)　　　　　　　　　　　　　　　圖2　雙倒數法　Fig.1　Molar ratio plots of DNA and Alizarin Yellow R(263nm)　　　　 Fig.2　Double reciprocal method(pH=7.40,293.65K,310.15K)　　　　cAYR=1.50×10-4mol/L;cDNA=8.00×10-7mol/L　　　　　　　　cAYR=1.50×10-4mol/L;cDNA=8.00×10-7mol/L

根據上述公式計算得到DNA與AYR的結合常數K293.65K=8.63×104L·mol-1和K310.15K=5.72×104L·mol-1，AYR與DNA相互作用的熱力學相關參數可以根據以下熱力學公式[5]進行：

(2)

(3)

(4)

由于溫度改變不大，所以近似認為焓不隨著溫度的變化而改變.再根據公式(2)到(4)計算得出：ΔrHm= -1.89×104J·mol-1，ΔrGm,293.65K= -2.77×104J·mol-1，ΔrSm,293.65K=30.1 J·mol-1·K-1，結果顯示ΔrGm< 0，這表明茜素黃R與DNA之間的相互作用是可以自發的進行；ΔrHm< 0，這就表明茜素黃R與DNA之間的相互作用為一個放熱的過程，又因為ΔrSmθ>0，所以該反應是由焓和熵共同驅動的[6-7].

2.3磷酸鹽對AYR的影響

由于DNA外部的磷酸骨架上含有大量帶有負電荷的磷酸基，這些磷酸基使得DNA在水環境中自由的舒展成線狀，所以用含有大量磷酸根離子的溶液與茜素黃R作用就有助于了解茜素黃R與DNA之間是否有靜電相互作用.本實驗用的是Na2HPO4.實驗結果如圖3所示.

通過磷酸鹽實驗可以看出，體系的吸收光譜在210 nm附近吸光度出現了一定的增加，故而AYR與DNA之間存在有靜電作用[8].

2.4熒光探針法研究AYR與DNA的相互作用

吖啶橙(AO)被廣泛用于生物光譜學的相關研究，它是一種偏堿性的染料，能夠與雙鏈DNA分子間的堿基以經典嵌插的方式發生作用，這種相互作用能夠使AO的熒光強度發生極大的提高，因此AO可以被用作為DNA分子的熒光探針[9-11].將AYR加入到AO-DNA體系中，測試結果見圖4，我們可以發現，體系測得的熒光值隨著AYR的加入，出現了小幅度的降低現象.這是因為體系中的AYR與嵌插在DNA分子中的AO發生了競爭的相互作用，說明AYR與DNA之間存在嵌插作用.

圖3　磷酸鹽對AYR影響的紫外吸收光譜　　　　　　　　　圖4　AYR對AO-DNA體系熒光光譜影響Fig.3 Influence of phosphate to UV-Vis absorption spectra of AYR(pH7.40)　　　Fig.4 The fluorescence spectra curve of the ARY to AO-DNA　　　cAYR=1.50×10-5mol/L;cNa2HPO4=1.00×10-3mol/L　　　　　　　　　cAO-DNA=1.20×10-5mol/L;cAYR=1×10-4mol/L

2.5AYR與DNA相互作用的Scatchard法研究

Scatchard法是用AO與DNA的嵌插復合物為基體，加入AYR后使其發生競爭，并且通過改變體系的離子強度，然后通過體系熒光光譜的變化來辨別AYR與DNA的作用方式的方法，Scatchard方程[12]可以用來解釋吖啶橙與DNA的反應特性：

(5)

公式(5)其中，r代表的是每個核苷酸所結合的AO分子的個數、n則代表了核苷酸所能夠結合的AO分子的最大取值、c代表了測試溶液中AO的即時濃度(即每次加入AO后所換算出的AO濃度)、K代表每個結合位點固有的結合常數.根據Scatchard方法，以r/c對r作圖，將所得點進行線性回歸，得到的直線方程的K值和n值見表1，根據表1可看出不管NaCl存在與否，Scatchard方程中的K值和n值均不相等，所以可以判斷AYR與DNA是混合作用方式，即存在嵌插和非嵌插作用，這個結果與之前的磷酸鹽和熒光探針分析得到的結果一致.

表1　茜素黃R與DNA相互作用的Scatchard方程

2.6粘度法分析AYR與DNA相互作用

圖5　ARY對DNA粘度的影響Fig.5　Effect of viscosity of ARY on DNAcDNA=1.20×10-5mol/L

根據實驗結果作圖5，如圖所示，粘度降低，這是茜素黃R與DNA分子以部分嵌插的方式相互作用的結果.以部分嵌插的方式發生相互作用的時候，DNA分子電荷失衡，分子扭曲變形，不再是長鏈，則粘度下降[13].

3結論

本文主要研究了AYR與DNA的直接作用，研究結果顯示AYR與DNA相互作用的摩爾比為4∶1；相互作用的熱力學參數分別為：ΔrHmθ= -1.89×104J·mol-1，ΔrGm,293.65K= -2.77×104J·mol-1，ΔrSθm,293.65K=30.1 J·mol-1·K-1，說明AYR與DNA的相互作用能夠自發的進行，為熵和焓共同驅動；作用類型為靜電和部分嵌插相互作用.

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[責任編輯：徐明忠]

Interaction between alizarin yellow R and DNA

OU Lianglong1,MA Yue2,WANG Xingming3

(1.Luoyang Bearing Research Institute, Luoyang 471039, China; 2.Luoyang Bearing Science&Technology Co.,Ltd.,Luoyang 471039, China; 3.Department of Chemistry, School of Materials Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621010, China)

Abstract:In this paper, we study on the molar ratio, mode of action, binding constant sand thermodynamic parameter of the interaction of herring sperm DNA (hsDNA) with small organic molecules(Alizarin yellow R).The interaction has been investigated by UV spectroscopy, fluorescence spectroscopy, thermodynamics, viscosity, etc.The results show that the molar ratio of AYR and DNA is 4∶1, the binding constants is K293.65K= 8.63×104 L·mol-1.The action type of AYR and DNA is Static and partial intercalation, both interactions can occur spontaneously and is driven by entropy and enthalpy.

Key words:alizarin yellow R; herring sperm DNA; mechanism

中圖分類號：O629.74

文獻標識碼：A

文章編號：1672-3600(2016)03-0040-04

作者簡介:歐亮龍(1988-), 男, 洛陽軸承研究所有限公司助理工程師, 碩士,主要從事分析化學方向的研究.

收稿日期：2015-07-20