RNA干擾在抑制PRRSV復制上的研究進展

樊宏超 姚睿智 鄧清華 馬德慧（內蒙古民族大學動物科技學院 內蒙古 通遼 028000）

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RNA干擾在抑制PRRSV復制上的研究進展

樊宏超 姚睿智 鄧清華 馬德慧*（內蒙古民族大學動物科技學院 內蒙古 通遼 028000）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起豬的一種病毒性疾病，給養豬業造成了巨大的經濟損失。目前還沒有有效的疫苗和治療藥物，急需采取一種新的研究策略。RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術已廣泛應用于抗病毒研究，本文將對近幾年RNAi技術在抑制PRRSV復制上的研究進展進行綜述。

PRRS是一種以導致懷孕母豬流產和仔豬呼吸困難為主要特征的疾病［1］。1990年在北美和歐洲首先發現了PRRS這種疾病［2］，1996年在我國大部分地區也發現有此病的存在；2006年我國10多個省份突然爆發高熱癥狀的PRRS，致使400多萬頭豬死亡［3］，給我國養豬業造成了巨大的經濟損失。雖然目前可應用PRRSV疫苗進行預防保護，但由于PRRSV具有高變異性，存在多個高度變異的區域，致使疫苗不能提供足夠的免疫保護作用［4］。此外，目前還沒有抗PRRSV的有效治療藥物，因此需要采取一種新的抗病毒策略。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種由雙鏈RNA（Double-stranded RNA，dsRNA）介導的以序列特異性誘導同源mRNA降解的轉錄后機制［5］。RNAi能夠有效的抑制病毒的復制，一些研究表明小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）或微RNA（microRNA，miRNA）靶向作用于病毒的特異基因能很好的抑制病毒的復制，同時還展現出抗病毒活性。

1 RNAi抑制病毒復制的作用機制

研究發現RNAi廣泛存在于各種生物體中，可以保護生物體基因免受外來基因的侵害，可有效地參與細胞防御與分化調控［6］。但目前針對RNAi的作用機制還沒有一個確切的結論，隨著研究的不斷深入，認為RNAi包括起始階段和效應階段。RNAi的起始階段主要發生在細胞質中，dsRNA通過外源導入、轉基因或者病毒感染等方式進入目的細胞，在Dicer酶的作用下將dsRNA切割成大小為21-23nt的雙鏈siRAN，siRNA是識別靶mRNA的標志，它的生成啟動了RNAi反應［7］；siRNA具有一條正義鏈和一條反義鏈，當siRNA與RNA介導的沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC）結合時，siRNA反義鏈在解旋酶作用下從RISC中分離出來，通過堿基互補配對原則與同源的mRNA特異性結合，同時釋放出siRNA正義鏈，在siRNA反義鏈介導下，RISC中的核酸內切酶切割與之互補的mRNA，導致mRNA發生降解，進而產生RNAi效應［8］。microRNA（miRNA）是一段長度為19～25nt的單鏈RNA（ssRNA），在介導RNAi過程中與siRNA有類似的功能，誘導靶mRNA的剪切或抑制mRNA的轉錄后翻譯過程。

2 RNAi在抑制PRRSV復制方面的研究

目前，RNAi技術被認為是抑制病毒感染的有效方法之一。可以通過化學合成、體外轉錄、病毒載體等方法獲得siRNA，通過化學合成獲得miRNA，利用其來進行RNAi技術在應用方面的研究。

2.1 靶向PRRSV結構蛋白基因在RNAi過程中的研究

（1）N蛋白是PRRSV的主要結構蛋白，占病毒蛋白總量的20%～40%，在PRRSV感染細胞中起重要作用。當N基因發生變異或受到抑制，將會導致整個病毒基因組功能喪失。楊閩南［9］根據N蛋白的特點，針對N基因篩選出3個高效靶位，構建出3個短發夾RNA（short hairpin RNA，shRNA 是siRNA的前體分子，在體內可被核酸酶切割成siRNA）干擾質粒，在MARC-145細胞上通過病毒滴度測定，間接免疫熒光檢測等技術驗證了RNAi靶向N基因抑制PRRSV的復制效果，結果表明shRNA干擾質粒能很大程度的降低病毒滴度，阻止細胞病變的形成。黃良宗［10］等也針對PRRSV N蛋白基因設計、合成了3個siRNA，并構建出3個siRNA表達質粒，在細胞水平上檢測了siRNA表達質粒對PRRSV復制的抑制效果，實驗發現將三種siRNA表達質粒共轉染細胞，能夠起到很好抑制PRRSV復制的效果。（2）GP3、GP4、GP5和M蛋白都是PRRSV的結構蛋白，在病毒感染機體的過程中都起到一定的調節作用。李紅梅［11］等針對GP3、GP4、GP5和M蛋白的基因構建出相應的shRNA干擾質粒，轉染細胞后能有效抑制PRRSV的增殖。周芳［12］根據PRRSV M及GP5蛋白基因結構序列分別設計合成了相應的shRNA，并將其鏈接到載體上，構建成RNA干擾載體，在轉染試劑介導下導入Marc-145細胞，同時接種PRRSV，48h后通過實時定量PCR檢測得知，這兩種干擾質粒均表現出抑制PRRSV增殖復制的作用。目前我們已經初步了解PRRSV結構蛋白在病毒感染機體中的作用，針對結構蛋白基因篩選合成相應的siRNA或shRNA，通過RNAi技術減少結構蛋白基因的表達，也許將為控制PRRSV感染提供一種可能性的策略。

2.2 靶向PRRSV非結構蛋白基因在RNAi過程中的研究PRRSV非結構蛋白是由ORF1a和ORF1b編碼的，并不是病毒粒子的組成成分，但卻在病毒的復制過程中扮演重要的角色。花婷［13］根據PRRSV 非結構蛋白12（nsp12）的基因序列設計合成引物，PCR擴增nsp12的全長基因，并將其與pEGFP-N1質粒相連接構建重組表達質粒，與針對nsp12基因合成構建的shRNA質粒，共同轉染Marc-145細胞，通過Western blot發現實驗組中PRRSV nsp12蛋白的表達量要明顯低于對照組；同時她也驗證了所構建的shRNA質粒對PRRSV的抑制效果，發現靶向nsp12設計合成的shRNA可以顯著降低細胞病變和PRRSV的感染率。Xie jie xiong［14］靶向PRRSV nsp9基因合成構建了siRNA重組質粒，將其轉染Marc-145細胞，接種PRRSV 24h后應用間接免疫熒光技術（IFA）、實時定量PCR等技術進行檢測發現，siRNA重組質粒能夠有效的抑制PRRSV nsp9基因的表達，與對照組相比可以使PRRSV nsp9基因的表達量減少86.56%～93.66%，為后續RNAi技術在抑制PRRSV復制的研究中提供了一定的基礎。

2.3 miRNA抑制PRRSV復制的研究 MiRNA在病原體與宿主的相互作用中起到重要的調節作用，能通過轉錄后調控基因的表達，進而調控病毒的感染。為找到PRRSV基因組RNA上存在的miRNA結合位點，Li li wei［15］等通過生物信息學軟件對PRRSV VJX143毒株進行了預測，結果發現僅有miR-130的結合位點位于PRRSV 5`UTR，同時發現它包含五個成員，分別是miR-130a、miR-130b、miR-1301b與miR-454，為探索miR-130與PRRSV復制之間的關系，合成了這5條miRNA模擬體，將其轉染Marc-145細胞，接種PRRSV進行檢測，發現轉染miR-130模擬體組的病毒滴度和PRRSV ORF7基因的表達量明顯低于對照組，說明miR-130在抑制PRRSV復制的過程中發揮了不可或缺的作用。張瓊［16］也通過生物信息學軟件篩選出宿主中可以負向調控PRRSV復制的多種miRNA，經過驗證發現在細胞中過表達miR-23、miR-378和miR-505能夠有效抑制PRRSV的復制。郭雪坤［17］通過應用RNA免疫共沉淀技術證明了miR-181能夠靶向PRRSV的基因組RNA，將miR-181模擬體轉染豬肺泡巨噬細胞（PAM）和Marc-145細胞，能顯著降低病毒滴度。可見利用內源性miRNA的表達來抑制PRRSV的復制，將是控制PRRS的一種新方法。

3 展望

RNAi技術是目前進行基因功能研究的一種主要方法，已被廣泛應用于基因治療、遺傳、信號傳導等多個科研領域，并且有力的促進了相關科學的發展。在高速發展的今天，隨著研究的不斷深入，人們對RNAi機理正逐步了解和明確。PRRSV作為一種RNA病毒，可以廣泛的應用RNAi技術對抑制PRRSV復制進行研究，并且已取得了重大的研究進展，篩選合成了多種能夠抑制病毒復制的siRNA、shRNA和miRNA序列。相信在不遠的將來，RNAi技術一定會從實驗轉入臨床應用，充分發揮其在疾病治療、預防等方面的作用，成功控制PRRSV感染將指日可待。

參考文獻

［1］Neumann EJ，Kliebenstein JB，Johnson CD，et al.Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome on swine production in the United States［J］.Am VetMed Assoc，2005，227:385-392.

［2］Collins JE，Benfield DA，Christianson WT，et al.Isolation of swine infertility and respiratory syndrome virus in North America and experimental reproduction of the disease in gnotobiotic pigs［J］.Vet，Diagn，1992，4:117-126.

［3］Tian ke gong，Yu xiu ling，Zhao tie zhu，et al.Emergence of fatal PRRSV variants； unpar alleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark［J］.PLos ONE，2007，2（6）526.

［4］Shi M，Holmes EC，Brar MS，et al.Recombination is associated with an outbreak of novel highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome viruses in China［J］.Virol，2013，87（19），10904-10907

［5］Zamore PD，Tuschl T，Sharp PA，et al.RNAi:double-stranded RNA directs the ATP-deendent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals［J］.Cell，2000，101:25-33.

［6］Downward J.RNA interference［J］.2004，328:1245-1248.

［7］Bernstein E，Denli AM，Hannon GJ.The rest is silence ［J］.RNA，2001，7:1509-1521.

［8］Hammond SM，Candy AA，Hannon GJ.Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA［J］.Nat Rev Gen，2001，2:110-119

［9］楊閩南.RNAi靶向PRRSV N基因GP5基因ADE表位缺失重組腺病毒免疫源性研究［D］.長春:吉林大學，2014.

［10］黃良宗，鐘科陽，王淑敏等.RNA干擾抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒N基因表達及病毒復制［J］.廣東農業科學，2011，38（11）:148-150.

［11］李紅梅，賀聰，張茂.shRNA抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）JXA1-R株在Marc-145細胞中復制及抗PRRSV細胞株的建立［J］.中國畜牧獸醫，2013，12（40）.

［12］周芳.靶向基因干擾家蠶及豬若干病毒的復制和增殖研究［D］.抗州:浙江大學，2012.

［13］花婷.靶向豬繁殖與呼吸綜合征病毒非結構蛋白NSP12的shRNA抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒在Marc145細胞中復制［D］.南京:南京農業大學，2012.

［14］Xie jie xiong，Zhou han，Cui jin，et al.Inhibition of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by specific siRNA targeting Nsp9 gene［J］.Genetics and Evolution，2014，28:64-70.

［15］Li li wei，Gao fei，Jiang yi feng，etal.Cellular miR-130b inhibits replication of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in vitro and in vivo［J］.SCIENTIFIC REPORTS.2015.

［16］張瓊.microRNAs調控豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染及致病性的機理研究［D］.北京:中國農業大學，2015.

［17］郭雪坤.宿主microRNA-181抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒復制的機制研究［D］.北京:中國農業大學，2014.

中圖分類號：S818.9

文獻標識碼：A

文章編號：1007-1733（2016）04-0050-02

基金項目：國家自然科學基金（31460662）

*通訊作者

收稿日期：（2016–01–21）