人組織激肽釋放酶對結直腸癌患者的預后判斷價值研究進展

李曉松,鄭軍,姚汝鋮,杜劍平,譚瀟,2

(1三峽大學第一臨床醫學院，湖北宜昌443003；2三峽大學腫瘤微環境與免疫治療湖北省重點實驗室)

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·綜述·

人組織激肽釋放酶對結直腸癌患者的預后判斷價值研究進展

李曉松1,鄭軍1,姚汝鋮1,杜劍平1,譚瀟1,2

(1三峽大學第一臨床醫學院，湖北宜昌443003；2三峽大學腫瘤微環境與免疫治療湖北省重點實驗室)

人組織激肽釋放酶(KLKs)是絲氨酸蛋白酶家族的一個蛋白水解酶亞群，廣泛存在于人的體液以及各種組織中，在正常組織中具有不同的生理功能。隨著研究的不斷深入，在結直腸癌組織中KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK10、KLK11、KLK14相對于鄰近正常組織表達顯著上調，與結直腸腫瘤的發展、侵襲和轉移顯著相關，均對結直腸癌患者的預后具有判斷價值。但是，由于結腸癌的發生是一個多因素、多途徑的過程，KLKs在結直腸癌中聯合運用判斷預后甚至作為有效生物標記的價值將進一步提高。

結直腸癌；人組織激肽釋放酶；預后價值

目前，隨著我國逐漸步入老齡化社會，伴隨著生活方式不斷發生改變，結直腸癌的發病率逐年上升[1]。早期研究發現，結直腸癌的發生與發展是一個伴隨腺瘤性息肉的產生、體細胞突變和異?；虮磉_的多步驟過程，而其中一些異常表達的分子如CEA能夠被用作獨立的預后因子參與癌癥分期和外科治療的擬定。但是，CEA和后來發現的一些血清學生物指標如CA199不僅缺乏敏感性與特異性，而且其與結直腸癌預后的關系也存在矛盾，為結直腸癌患者的預后判斷埋下隱患。人組織激肽釋放酶(KLKs)是絲氨酸蛋白酶家族的一個蛋白水解酶亞群，其編碼基因均位于19q13.3～q13.4，包含接近300 kb的連續基因序列，共編碼15個蛋白KLK1～15，廣泛存在于人的體液以及各種組織當中。在正常組織中，KLKs表達具有顯著差異性，并涉及各種正常生理功能，包括從血壓調節到組織重塑、激素調節到皮膚脫屑等[2]。而在腫瘤組織中，KLKs與腫瘤的進展、侵襲和轉移相關聯[3]。最近研究顯示，KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK10、KLK11、KLK14在結直腸癌組織中相對于鄰近正常組織表達顯著上調。因此，KLKs對結直腸癌患者的預后價值逐漸被人們所認識，并在過去的10年間成為研究熱點?，F就KLKs對結直腸癌患者預后的判斷價值研究作一綜述。

1　KLK4

KLK4又被稱為前列腺酶或者KLK-L1，最初被認為只在前列腺中表達，然而后來發現KLK4基因轉錄同樣也發生在其他的組織內，包括睪丸、乳房、子宮、腎上腺、甲狀腺和唾液腺，即使都處于一種很低的表達水平[4]。Obiezu等[5]研究證明，KLK4表達上調是卵巢癌患者預后不佳的獨立預后因子，并且腫瘤分期越高，表達含量也隨之提高。Kontos等[6]在對81例結直腸腺癌患者腫瘤組織分析后發現，患者Dukes分級、腫瘤侵襲性和病理分級以及腫瘤大小與KLK4表達狀態正相關；生存分析顯示，KLK4是結直腸腺癌患者預后不良的標記因子，預示了不理想的無病生存期(DFS)，而且無需考慮淋巴結狀態和腫瘤大小的影響。此外，KLK4還能夠預測淋巴結陰性和Dukes分級早期階段結直腸癌的短期復發率。因此，我們認為KLK4具有獨立于Dukes分級與病理分期之外的巨大臨床應用價值。

2　KLK5

KLK5最早是作為乳腺癌的預后因子被提出的，其表達上調往往代表預后良好[7,8]。Talieri等[9]收集了122例原發性結直腸癌患者的病例資料進行統計分析，采用酶聯免疫法分析KLK5～8、KLK10、KLK11、KLK13～15這9種KLKs在結腸腫瘤組織與鄰近正常組織的差別。單變量分析發現，KLK5、KLK6、KLK7和KLK13與總生存期(OS)和DFS的關系顯著(P均﹤0.05)，但是一旦將年齡、TNM分期和分化差異的影響納入分析中，僅KLK5(HR:1.24,95%CI:1.05～1.47)，KLK7(HR: 1.57,95%CI: 1.04～2.37)和KLK14 (HR: 1.43,95%CI: 1.05～1.94))在OS的差異具有顯著性。由此可見，KLK5 在大腸癌發生發展中起重要作用，有望作為臨床上判斷大腸癌患者惡性程度、選擇治療方法及評估預后的客觀指標，為臨床治療提供可靠依據。

3　KLK6

KLK6的cDNA首先由Anisowicz等于1996年運用一種特異性顯示技術從原發性和轉移性乳腺癌細胞系中分離出來，最初這種表達產物被命名為蛋白酶M，并發現蛋白酶M的mRNA在某些乳腺癌細胞系和卵巢癌組織中表達上調，可能在腫瘤進展中起到一定作用，甚至可能成為腫瘤理想的生物標記因子。目前研究已發現，KLK6是卵巢癌潛在的診斷生物標記[10]，而在結直腸癌中KLK6的表達與卵巢癌一樣呈表達上調狀態[11]。為了證明KLK6是否在結直腸癌中也具有診療與判斷預后的價值，Ogawa等[12]運用RT-PCR技術分析了63例原發性結直腸癌患者病理組織標本，發現KLK6 mRNA在腫瘤組織與正常結腸黏膜組織中的表達存在顯著性差異(P<0.01)；并且，KLK6 mRNA高表達與漿膜侵襲、肝轉移和Dukes分級呈顯著相關，低表達患者5年內的生存率比高表達者高出近20%。另外，有研究表明KLK6表達與結直腸癌患者TNM分期、淋巴結轉移、肝轉移情況及腫瘤分化程度相關[13]，單因素分析結果顯示KLK6與DFS顯著相關(P<0.05)[9]。這與卵巢癌中KLK6作為不良預后因子的報道相似[10, 11]。2014年一份最新的報道顯示，采用半定量PCR法檢測232例結直腸癌患者樣本后發現，KLK6與患者OS和DFS顯著相關(P=0.002，P=0.017)[14]。因此，KLK6有望作為結直腸癌患者預后不良的一種生物指標[15]。雖然，至今KLK6在結直腸癌進展中的生物機制仍不十分清楚，但其判斷預后及幫助診斷的潛在價值值得進一步研究。

4　KLK7

作為編碼角化層糜蛋白酶的基因，KLK7首先由Egelrud從皮膚當中純化分離而來，隨后經不斷研究人們逐漸了解了其基因組的特征、組織表達和激素調節的機制[16]。研究發現，KLK7與KLK5一同催化了角質層細胞之間緊密連接結構的降解，這非常類似于KLK7在腫瘤中降解細胞外基質從而促進腫瘤轉移的過程。因此，可認為KLK7在腫瘤生成及進展中扮演重要角色[17]。在正常組織中，KLK7在子宮頸、卵巢、睪丸、食管和胃中表達上調，但卻在結腸組織中表達下調。在腫瘤組織中，它既可處于表達上調狀態(卵巢癌，結直腸癌，子宮頸癌，口腔鱗狀上皮癌)，也可處于表達下調狀態(黑色素瘤，前列腺和肺癌)，甚至兩種狀態都可能出現(乳腺癌)。目前，在細胞層面已證實，KLK7在結腸癌組織中異常表達并參與癌細胞增殖進展過程的證據，提示KLK7可能是潛在的治療靶點[18]。另外，Devetzi等[19]收集175例結直腸癌患者共計245例病理組織，采用Real Time Q-PCR法檢測KLK7，證實KLK7在結直腸癌組織中的表達與正常組織存在顯著差異，并與淋巴結狀態、TNM分級和DFS顯著相關(P均<0.01)。值得注意的是，在不同的人群中，KLK7表達與DFS、OS的聯系程度不同(P=0.015，P=0.004)，在日本結腸癌患者中KLK7僅與OS相關。而Talieri等[20]采用同樣的方法證明了KLK7與OS和DFS的關聯均具有顯著性。盡管KLK7表達與DFS、OS的相關性還值得進一步研究，但結直腸癌中KLK7表達上調毋庸置疑，這也往往預示結直腸癌患者預后不良。

5　KLK10

KLK10也被稱為正常上皮特異性基因1(NES1)，總長5.5 kb，包含6個外顯子和5個內含子，編碼了1種包含276個氨基酸的絲氨酸蛋白酶，相對分子質量為30 kD[21]。KLK10在多種組織中廣泛表達，如唾液腺、卵巢、乳腺、前列腺和睪丸，但其基本生理功能和作用仍不清楚。盡管如此，近年來研究已發現KLK10被類固醇激素如雌二醇和睪酮調控，這也提示其可能在內分泌相關腫瘤的發生和進展中扮演重要角色[22]。此外，KLK10表達上調與卵巢癌腫瘤大小、分期、DFS和OS有顯著關聯已被證實，而KLK10聯合乳腺癌固有生物指標作為乳腺癌預后因子的方案也已被提出[23]。 Alexopoulou等[24]通過RT-PCR法分析發現，190例結直腸癌患者組織標本KLK10顯著上調(P<0.001)， 且與TNM分期和Dukes分級顯著相關(P=0.036，P=0.025)，KLK10高表達者DFS和OS更短。Talieri等[25]也用同樣的方法檢測119例結直腸癌患者的組織標本，發現KLK10與患者TNM分期顯著相關(P=0.028)，但與Dukes分期關聯不顯著。最近研究顯示，KLK10表達與結直腸癌TNM分期和Dukes分級相關(P=0.036，P=0.025)，KLK10高表達者DFS和OS更短(P=0.014，P=0.020)[26]。此外還發現，KLK10在結直腸癌患者中與肝轉移相關(P=0.035)[27]。隨著對KLK10功能研究的不斷深入，KLK10不僅可作為一種新的生物指標，更可能成為一種有前途的治療靶點。

6　KLK11

KLK11最初是從人類大腦海馬回中分離出來的，但后來發現它在人體很多組織如皮膚、唾液腺、胃、前列腺和腸道都有表達。近年文獻報道，KLK11在70%的卵巢癌和60%的前列腺癌中表達上調。提示KLK11可能是卵巢癌或前列腺癌潛在的生物指標[10]。Shigemasa等[28]發現，卵巢癌組織中KLK11表達上調是患者預后不良的生物指標。為證明KLK11在結直腸癌中同樣也具有巨大的臨床價值和意義，國內學者Yu等[29]采用免疫組化法檢測126例低位直腸癌患者的組織標本。結果顯示，低位直腸癌患者KLK11表達上調幅度與患者Dukes分期(P<0.001)、組織分化(P=0.003)、CEA程度(P=0.010)、淋巴結轉移狀態(P<0.001)和侵襲深度(P=0.002)顯著相關，KLK11高表達者5年生存率58.23%明顯低于低表達者的80.85%，線性回歸分析提示Dukes分級、淋巴結轉移狀態和侵襲深度可能是低位直腸癌患者判斷預后的獨立指標(P均<0.05)。Alexopoulou等[24]采用RT-PCR法檢測120例結直腸癌及其鄰近正常組織標本，發現KLK11 mRNA在腫瘤組織中轉錄水平顯著上調，KLK11 mRNA水平與腫瘤侵襲深度和病理分級均顯著相關(P=0.013，P=0.004)，而且也是OS和DFS不良預后的獨立預測因子(P=0.026，P=0.048)。由此可見，KLK11具有顯著的預后價值用于指導術后治療，特別是評估高侵襲性腫瘤和淋巴結轉移患者的預后。

7　KLK14

作為KLKs中惟一一種既有胰蛋白酶活性也有糜蛋白酶活性的絲氨酸蛋白酶，KLK14在人體正常組織中如腦和前列腺中高表達，而在結腸中呈低表達狀態，并且其表達受到類固醇激素的調控[2]。近年來研究發現，KLK14在腫瘤細胞中大量表達，并且通過激活蛋白酶活化受體(PARs)途徑促進腫瘤發生[30]。Devetzi等[19]采用RT-PCR法檢測245例結直腸癌患者腫瘤病理組織的KLK14，表達上調者DFS和OS都會減少(P=0.003，P=0.016)，ROC分析表明KLK14與KLK7均在結腸癌與結腸腺瘤中的表達具有顯著差異，且KLK14差異更顯著(KLK14，AUC=0.708；KLK7，AUC=0.669)；但是，遺憾的是由于實驗組織標本來自不同患者，得到KLK14在腫瘤與正常組織間表達含量無顯著差別這一不準確的結論。盡管如此，KLK14能作為預后因子，并且與KLK7一起預測結直腸癌患者預后的價值不容忽視。

綜上所述，KLKs不僅在不同的正常生理功能中起重要作用，在腫瘤進展的不同階段也表現出不同的意義。由于類固醇激素在KLK基因轉錄過程中扮演著重要角色，KLKs已被廣泛的用作惡性腫瘤的生物標記，特別是在有類固醇激素調控的腫瘤中，如乳腺癌、睪丸癌、卵巢癌；而結直腸由于生理性固醇含量較高，因此KLKs在結直腸癌中的研究價值可能更高[31]。由于結腸癌的發生是一個多因素、多途徑的過程，目前發病機制尚未完全闡明，標志物的敏感性和特異性還有待進一步提高，以逐漸克服傳統結直腸癌標志物的單一性和局限性。至今，KLKs在結直腸癌中的研究已取得了許多成果，KLKs在結直腸癌中的預后價值也已被學術界肯定，相信隨著基礎研究和技術手段的不斷發展，KLKs在結直腸癌中聯合運用判斷預后甚至作為有效生物標記的價值將進一步提高。

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三峽大學人才科研啟動基金(KJ2014B070)；三峽大學腫瘤微環境與免疫治療湖北省重點實驗室開放課題基金(2015KZLO4)。

譚瀟(E-mail: xiao-tan@hotmail.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.34.038

R735.3

A

1002-266X(2016)34-0099-04

2016-05-17)